木本植物miRNA 研究进展

张宇董国颂张廷婷

(青岛大学生命科学学院，山东青岛 266071)

miRNA(microRNA)是一类长度为18 ～23个核苷酸的内源性单链非编码小RNA，通过特异性mRNA 降解或翻译抑制调控基因表达[1-2]。 研究表明，miRNA 具有多种生物活性，参与神经、激素信号转导等途径，调控细胞凋亡、生长发育等过程[3-5]。 已知miRNA 广泛存在于动植物及病毒[6-8]中，迄今，miRNA 数据库(miRBase，http:/ /mirbase.org/)存在近300个物种的miRNA 信息，其中包含近200个植物基因组[9]。

木本植物在森林中占据主导优势，多分布于亚洲、欧洲以及北美各地区，具有极高的经济与生态价值。 目前，木本植物miRNA 及其在遗传育种方面的研究已有报道[10]，但大部分物种的miRNA数据仍需要完善，比如黑松的基因组测序尚未报道，其转录组和miRNA 注释信息匮乏，桑树和果树等经济树种的miRNA 信息也相对较少；有关植物miRNA-靶基因的互相调控作用已有不少研究，但是关于miRNA-靶基因在不同基因家族之间以及不同物种之间相互联系的报道并不多见。本文从生长发育、非生物胁迫和生物胁迫等方面，探讨木本植物miRNA 的国内外研究进展，综述miRNA 在木本植物中的作用，为植物miRNA 及其靶基因调控分子机理研究提供借鉴和参考。

1 miRNA 在木本植物生长发育中的作用

作为重要的调节分子，miRNA 几乎参与了木本植物所有重要的发育过程，如根的生长、开花时间、花粉的萌发表达、胚胎的诱导发育等，在植物生长发育过程中发挥着重要作用。

植物体细胞胚胎发生与发育的过程极其复杂，牵涉到大量miRNA 及靶点的差异表达，多项研究证实miRNA 是诱导胚胎发生的关键调控因子。 如落叶松miRNA 的发现与探究多与胚胎和愈伤组织相关:在落叶松中上调miR171 的表达，可导致靶基因SCL6下调及诱导体细胞胚胎[11]和胚性愈伤组织的发育[12]；分生组织的细胞增殖由miR397 和miR398 共同控制，促进单胚阶段的发育；miR156、miR159、miR160、miR166、miR167 和miR390 构成调控网络，在子叶胚发育过程中发挥调节作用；miR162 和miR168 参与调控胚胎的整个发育过程[13]。 在火炬松中，miR166 影响胚胎发育成熟的时间，而不是子叶胚发育过程[14]。

在根部发育阶段， miRNA 靶向调控植物根系的发育及结构形态，维持植株自身的生长。 在杨树根系发育过程中，miR476a 靶向调控基因RFL介导线粒体-生长素信号级联反应，诱导不定根的形成[15]；过表达miR167a 或沉默靶基因ARF8.1促进不定根数量增多，轻度抑制侧根的发育[16]；脱落酸(ABA)与黄素类固醇(BR)、赤霉酸(GA)通过信号串扰影响miRn68 和miR4776b 的表达，调节根系发育机制，提高植株对更复杂环境的适应性[17]。 另外，过表达miR396 调节靶基因GRFs下调，参与根端细胞的发育，直接或间接影响落叶松的子叶形态建立与生根过程[18-19]。 上调miR171 表达，分别导致靶向GRAS(SCL6-Ⅱ、SCL6-Ⅲ和SCL6-Ⅳ)转录因子下调，以及影响高山松叶形、初生根的生长和开花时间[20-24]。 苹果树中miR171、miR396 与miR156、miR166、miR319共同作用，促进细胞增殖分化，有助于其砧木在无性繁殖过程中形成不定根[25]。

植物的营养生长是幼年期转向成年期的重要过程之一，研究表明此过程也存在多种miRNAs的调控诱导。 单核苷酸多态性(SNP)关联研究表明，杨树中 miR160a 靶向生长素响应因子(ARF16)、 miR167a 靶向生长素响应因子(ARF8)、miR6443 靶基因阿魏酸5 -羟化酶(F5H)、miR475b 靶向五肽重复超家族基因(PPR1、PPR2、PPR3、PPR4)和miR156c 靶向鳞状体启动子结合蛋白样基因(SPL15、SPL20、SPL25)等，构成木质结构的多因素遗传网络，在树木生长和木材性状形成过程中提供潜在的调控作用[26-31]；值得注意的是，miR319a 的表达水平在树木的初级到次级生长过程中逐渐降低，靶基因TCP20可结合WOX4a控制维管形成层增殖，促进次生木质部分化，对树木的次级生长起着重要调控作用[32]。

近些年来，越来越多的miRNA 被证实通过抑制或促进靶基因来调控植物的开花与果实成熟时间。 Zhang 等[33]在桃中发现了 miR171a、miR171b、miR399 和miR408 等8个miRNAs 的存在，其中miR171 诱导桃树开花与果实发育，miR171a 在果实中高表达，miR171b 在花和幼叶中高表达，且在花中的含量远高于幼叶和嫩茎。MiR156 的表达水平下降导致茶树形成不育花芽，影响有性繁殖[34]。 MiR159、miR828 和miR858 靶向49个MYB基因，其中19个调节苯丙烷类代谢，参与核硬化和果实颜色发育的相关途径，促进桃树果实成熟[35]。 此外，miRNA 还可以调控植物体内激素、蛋白等合成与代谢，维持植株的正常生长发育。 研究发现，在毛果杨中，miR171 家族除了调控GRAS 转录因子，还与信号传导蛋白、蛋白激酶和水解酶等的基因相关[36-37]。 在马尾松中，miR171 和miR397 调控次生生长、激素信号转导等多个过程[38]。 落叶松中，miR11467 在响应胁迫、激素等外界刺激以及苯丙烷生物合成等次生代谢途径中发挥着重要调控作用[39]。 另外，在乌龙茶晾晒阶段，miR167d、miR845、miR166d 和miR319C3 促进黄酮类化合物的积累，miR171b 和miR166d 共同参与萜类化合物的生物合成，有助于乌龙茶形成独特的香气和风味[40]；同时，过表达miR156 抑制其靶基因SPL的表达，进而通过调节DFR基因介导儿茶素的生物合成与积累[41]。

这些研究结果表明，miRNA 通过阶段特异性靶向基因广泛调节植株的生长发育过程，且在不同植物中其功能会随着组织不同而发生改变。 总体而言，在植物生长发育期间，miRNA 参与调控至关重要，不仅能促进或抑制靶基因的表达，也与多种功能蛋白和激素相关，并存在合作性结合方式，展现出miRNA 的调控能力。

2 miRNA 在木本植物生物胁迫中的作用

病原物的入侵通常会影响植物的正常生长，相关的激素信号和化合物合成与转移等也会受到显著影响，而miRNA 的表达变化可诱导植物调节对疾病的抵抗能力。

已有研究发现，松材线虫侵染马尾松后，针叶中miRNA 表达变化明显，一方面miR384 通过靶向pre-mRNA-splicing factor SPF27，miR6196 和miR5059 调控核糖相关蛋白，进而参与RNA 剪接，在转录水平上响应松萎蔫病[42]。 另一方面，降低miR5658 与miR946 表达，分别导致对应的保守激酶2 和P-Loop 结构域、CC-NBS-LRR 和LRR 等抗性基因表达上调，提高松树抗松材线虫病的能力；还可以通过miR585 调控转录因子MBF1，影响其植保素类物质合成的上游调控基因，促进植保素的合成，在次生代谢方面参与植物的防御过程[43]。 锈病是危害杨树的病害之一，在叶锈真菌侵染的条件下，miR482b 的表达受到抑制，导致抗病性TIR-NBS-LRR 蛋白快速积累[44]，miR159 和miR858 家族调控转录因子R2R3-MYBs 的表达，参与水杨酸、茉莉酸、乙烯和脱落酸等多个植物激素的代谢途径[45]。 当杨树受到内生链酶菌SSD49 侵染时， 过表达miR160、miR156 和ptc114，或者沉默miR319 会导致编码转录因子(生长素反应因子和GRAS 蛋白)、抗病蛋白、植物激素氧化酶和应答调节因子的基因差异表达，响应胁迫[46]。 斜纹夜蛾取食诱导茶树中miR160、miR166、miR393、miR319 和miR2118 家族成员表达，参与植物基因抗生物胁迫响应的转录过程[47]；当茶树感染炭疽病时，5种miRNA(PC-5p-80764_22、miR160c、miR828a、miR164a 和 miR169e) 的表达谱与其靶标(WRKY、ARF、MYB75、NAC 和NFY 转录因子)呈负相关，进而参与生长素、ROS 清除、水杨酸介导途径、受体激酶、转录因子的调控，诱导茶树对胶孢炭疽菌胁迫的应激反应[48]。

果树的抗病性和胁迫响应能力亟待提高。 当桃树被不同病毒/类病毒(茎痘相关病毒、桃潜隐花叶类病毒)感染后，miR482d-5p、miR6271 和Pp06-33439 在叶片和果实组织中的表达持续增加，靶基因包括钙调素结合蛋白(miR482d-5p)、E3 泛素蛋白连接酶UBR4(miR6271)、Dof 锌指蛋白(Pp06-33439)在叶片和果实组织中的表达水平呈负相关[49]。 Ma 等[50]证实了miRln11 通过切割调控NBS 蛋白类基因的表达，响应苹果树的抗病性。 在苹果火疫病的抗病和感病品系中，miR169a、miR160e、miR167b-g 和miR168a/b 的表达水平发生了明显变化[51]。 苹果树在轮纹病的胁迫下，miR827a、miR397a、miR2111a、miR167a和miR395a 的表达显著增加，涉及疾病应激下对靶基因的动态调控[52]。 另外，过表达miR390a 抑制MdRPK2和MdLRR8基因的表达，miR156ab 和miR395 分别负向调控转录因子WRKYN1(含有TIR 和WRKY 结构域)与WRKY26(包含两个WRKY 结构域)，提高苹果树对叶斑病真菌的抗性[53-54]。

越来越多的研究显示，miRNA 在植物抵御生物胁迫过程中具有重要作用，并通过不同生物学途径共同发挥作用，如抗病蛋白NBS-LRR、植物激素信号途径和氧化还原等多种途径，维持不同结构中基因的协调，引发植物的系统防御。 这也意味着miRNA 在植物抵御生物胁迫过程中的调控机制极其复杂。

3 miRNA 在木本植物非生物胁迫中的作用

在不同的逆境胁迫条件下，植物体内会发生一系列应激反应以抵御这些不利因素造成的伤害，以便获得更好的生长发育。 研究表明，miRNA是植物应对逆境胁迫过程中的主要调节因子之一，通过降解、翻译抑制或正向激活等方式作用于靶基因，进而使植物对逆境胁迫做出应答。

Fan 等[55]研究发现无机磷胁迫会影响马尾松中miR399、miR169 和miR156 等几个家族的表达，通过上调或下调有效地促进马尾松的正常生长。 在杨树中过表达miR162、miR393 和miR399，能使转运蛋白含量增多，通过调节Na+和K+动态平衡等途径响应低氮胁迫[56]。 低温胁迫下，杨树miR319、 miR159、 miR167、 miR395、 miR390 和miR172 及其靶基因MYB、SBP、bZIP、ARF、LHW和ATL，参与ARF 通路、SPL 通路、DnaJ 相关光系统Ⅱ和LRR 受体激酶合成，通过其动态表达响应极端季节性气候变化抵抗寒害[57]。 杨树中的miR396e 和 miR396g、 miR156i 和 miR156j、miR390c 转换为甲基化模式，miR172d 对靶基因PuGTL1的负向调控，miR164a-e、miR164f(靶向NAC基因)和miR6445、miR6427(靶向PHAS基因)的组织特异性表达，均与杨树的耐旱性相关[58-61]。 刘志祥等[62-63]发现miR169 和miR156基因家族形成调控网络，参与毛果杨的生长发育过程及对外界的适应性。 miR164 通过调控靶基因NAC家族，在植物激素信号传导、生长发育及胁迫应答等方面起着重要作用[64]。 茶树中miR166 家族表达下降，负向调控靶基因ATHB-14和ATHB-15，参与根尖发育，应对干旱胁迫[65]。

当苹果树处于干旱环境时，miR399 负向介导植物抗旱性， 而 miR156、 miR166、 miR172 和miR319 则正向调控[66]；敲除miR171i 或过表达其靶基因SCL26.1都可提高苹果树的抗旱性[67]。另外，miR156a/SPL 还可以过表达MdWRKY100来增强苹果树的耐盐性[68]。 在干旱条件下，桃树中miR156、 miR159、 miR160、 miR167、 miR171、miR172、 miR398、 miR403、 miR408、 miR842 和miR2275 的表达水平发生明显变化，其靶基因多与DNA 结合和催化活性相关[69]。 相反，在高水分综合征的桃树叶片中，Diler 等[70]鉴定了24个已知miRNAs 和3个新miRNAs，其靶基因多参与物质运输、角质层发育和抗胁迫反应，并推测miR5021 和miRnovel2 可能在应激反应中发挥着关键作用。

植物体对非生物胁迫的响应是动态且复杂的，通过上调或下调miRNA 直接或间接地影响靶基因的表达水平，形成一系列抵御非生物胁迫的机制。 但miRNA 及靶基因在组合型胁迫下的响应过程是否发生改变，还需深入研究。

4 总结与展望

目前已在不同物种中发现多种miRNA，单个或多个miRNAs 及其靶基因构成较为严密的调控机制，在植物的生长发育、代谢调控、非生物和生物胁迫应答等各个方面发挥作用，以确保植物体内各种过程的正常运行，维持植物的正常生长状态[71]。 然而，有些miRNA 虽已被发现，但其功能尚不明确，且由于许多木本植物的全基因组测序尚未完成，数据库中可用的信息资源匮乏，miRNA还未被发掘[72]，因此，有关木本植物miRNA 的研究仍需完善和深入。 另外，目前的研究大多局限于单个miRNA 与靶基因的功能分析，缺乏针对不同物种的组织特异性调控过程及其调控网络运行机制的整体性、系统性研究，同时对miRNA 响应多重胁迫的交互分析也较少，缺少植物miRNAs与其他物种(动物、微生物等)基因互作的研究。许多木本植物的组织培养再生体系和遗传转化体系尚未建立，也限制了miRNA 相关植物基因工程的进一步研究。

在今后的研究中，可结合高通量测序、降解组测序、生物信息学分析等不断改进miRNA 研究手段，完善黑松、桑树等木本植物的全基因组数据及基因功能注释信息等，通过不同发育阶段、不同胁迫条件、不同部位及不同物种间miRNAs 的差异表达等研究，完善木本植物miRNA 的特征信息及发现更多具有调控作用的新miRNAs。 构建参与多种生物学过程的单个miRNA-靶基因及协同调控同一应答过程的多个miRNA-靶基因的分子调控模型。 建立更多木本植物的组织培养再生体系和遗传转化体系，有助于利用基因工程手段更加深入地解析miRNA 的作用机理和调控路径，也将为完善木本植物miRNA 数据提供材料。 木本植物的miRNA 研究可为植物分子育种提供重要的理论依据。