系统性红斑狼疮患者血清C5a、HMGB1、sCD163水平变化及其临床意义

王磊，王元元，赵远

（洛阳市第一人民医院检验科，河南 洛阳 471000）

系统性红斑狼疮 （Systemic lupus erythematosus，SLE）是一种以累及多系统、多脏器的全身结缔组织炎症反应为表现的自身免疫性疾病。 一般认为与遗传、环境、免疫和内分泌异常等因素有关[1]。目前SLE 尚未治愈方法，随着病情发展，SLE 患者出现继发感染的比例也随之增加。 极大影响SLE患者的生命质量[2]。 血清过敏毒素由一个活性片段C5a 组成，其可在补体激活过程中产生并对炎症介质作出反应。 补体C5a 表达升高表示其可能参与到SLE 神经系统损害的过程而介导炎性反应。HMGB1 属于有致炎作用的核蛋白。 sCD163 属于CD163 的脱落形式，在炎症反应刺激下，外周血中sCD163 水平可明显升高。既往研究表明，当补体活化过程中出现炎症反应后，C5a 便趋化炎症细胞活化、聚集，引起血管扩张、支气管痉挛等炎症反应，阻挡线粒体代谢引导糖尿病、 肾病、 肾损伤[3]。HMGB1 在中枢神经系统中可介导中枢的炎性反应， 且可能成为自身免疫治疗的靶向分子[4]。sCD163 可能作为炎症介质参与SLE 的免疫病理机制[5]。 因此，本研究探究了系统性红斑狼疮患者血清C5a、HMGB1、sCD163 水平变化及其临床意义，旨在指导临床对诊断、评估SLE 活动度及疾病严重程度。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2020 年1 月至2021 年1 月在本院确诊的71 例SLE 患者设置为SLE 组，男11 例，女60 例，年龄18~61 岁，平均（34.58±4.77）岁。 选取2020 年1 月至2021 年1 月在本院接受体检的健康志愿者35 例设置为对照组， 男4 例，女31 例，年龄18~55 岁，平均（34.29±4.29） 岁。

纳入标准：（1） 本研究所有SLE 患者均符合SLE 诊断标准[6]；（2）年龄＞18 岁，有一定认知能力；（3）经医院伦理委员会通过，研究对象及家属了解并知情同意。 排除标准：（1）本研究内SLE 患者合并其他类型自身免疫性疾病者；（2）伴有重要器官严重疾病者；（3） 在研究时间内伴有急慢性感染者；（4）伴有糖尿病、恶性肿瘤者。

选取2020 年1 月至2021 年1 月在本院确诊的71 例SLE 患者，根据SLE 活动性指标评分结果分组， 选取SLEDAI 评分＜5 分的SLE 患者为无活动组（n=28 例），SLEDIA 评分≥5 分的SLE 患者为活动组（n=43 例），并选取同期在本院接受体检的健康志愿者为对照组（n=35 例）。无活动组男3 例，女25 例，年龄20~61 岁，平均（33.97±4.92）岁；病程4 个月~7 年，平均（3.17±0.66）年。 活动组男8例，女35 例，年龄18~59 岁，平均（34.98±4.67）岁；病程5 个月~8 年，平均（3.41±0.56）年。 对照组男4例，女31 例，年龄18~55 岁，平均（34.29±4.29）岁。所有研究对象年龄、 性别等一般资料无明显差异（P＞0.05）；无活动组与活动组患者病程无明显差异（P＞0.05）。

1.2 检测方法

1.2.1 主要设备与试剂盒 设备： 德国Hettich MIKRO220/220R 离心机、超低温冰箱（深圳海思安生物技术有限公司）、ThermoFisher Multiskan GO全波长酶标仪 （450 nm）（北京赛百奥科技有限公司）、37 ℃恒温箱、蒸馏水或去离子水、高精度加样枪及枪头：0.5~10 μ L、2~20 μ L、20~200 μ L、200~1 000 μ L。

试 剂 盒：HMGB1 ELISA 试 剂 盒、sCD163 ELISA 试剂盒、 人补体片断5a （C5a）ELISA 试剂盒、96 孔 微 孔 酶 标 板，C5a 标 准 品0.3 mL*6 管、HMGB1 标准品400 ng/瓶， 人sCD163 酶标抗体、洗涤缓冲液、终止液、底物工作液、封板膜。

1.2.2 采集样本与标本处理 分别采集三组研究人员清晨空腹状态下外周静脉血。 将血清、血浆用蒸馏水作1：10 倍稀释 （取20 μ L， 加标本稀释液180 μ L，稀释10 倍）得到标本稀释液。采用浓缩洗涤液与重蒸水配比呈1：20， 稀释20 倍得到洗涤液。 配制标准品在使用前加入1 mL 蒸馏水混匀，得到400 ng/mL 的标准品液。

补体C5a： 选择EDTA 或肝素作为抗凝剂，在标本采集30 min 内位于2~8 ℃离心15 min， 取上清液置于－80 ℃或－20 ℃保存。

HMGB1：选择EDTA 作为抗凝剂，在2~8 ℃保存48 h， 在-20 ℃或-70 ℃保存更长时间。 选取8根管作为标准管。 第一管加入标本稀释900 μ L，第二至第八管加入标本稀释500 μ L。 将100 μ L的400 ng/mL 标准溶液加入第一管， 混合均匀，然后用取样器吸出500 μ L，移至第二管。 重复这样做多次稀释，从第七管虹吸出500 μ L 并弃掉。 第八管是空白对照。

sCD163：选择EDTA 或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10~20 min 后2 000~3 000 r/min 离心20 min。 收集血清，如在储存过程中发生沉淀，应再次离心。

1.2.3 检测步骤 补体C5a：取出恒温下板条，在预先包被人C5a 捕获抗体的包被微孔中，加入标本、不同浓度标准品，用封板胶纸封住反应孔，经37 ℃恒温箱孵育90 min 并彻底洗涤。洗板5 次，空白孔加入HRP 标记的检测抗体稀释液和抗体工作液，用新封板胶纸封住反应孔，37 ℃恒温箱孵育60 min。洗板5 次，在空白孔中加入酶结合稀释剂，在其他孔中加入酶结合工作液。 用新封板胶纸封住反应孔，37 ℃恒温箱，避光孵育30 min。洗板5 次，采用底物TMB 显色，避光36 ℃孵箱，避光孵育15 min。加入终止液混匀，采用酶标仪（450 nm）测定吸光度（OD 值），并计算最终标本浓度。

sCD163： 采用双抗体夹心酶联免疫法检测sCD163 水平。 人sCD163 抗体预涂于微孔板上，再将标准品、样品依次加入一排七孔中，一孔只加入标准稀释液，其余孔加入待测样品。 胶条覆盖，室温孵育2 h，每孔加入sCD163 与抗体结合，采用洗涤液洗板5 次，去除未结合的物质后，将人sCD163 hrABS 添加到每个微孔中，形成抗体-抗原-hrABS复合物，胶条覆盖，室温孵育2 h。 采用洗涤液洗板5 次后，再加入底物溶液，室温避光孵育30 min 使之显色。 采用酶标仪（450 nm）测定OD 值，并计算最终标本浓度。

HMGB1：采用双抗体夹心ABC-ELISA 法检测HMGB1 水平。 每孔加入标准品或待测样品，充分混合反应板，37 ℃静置2 h。采用洗涤液洗板5 次，在滤纸上晾干。 在每孔中加入第一份抗体工作液。反应板充分混合，37 ℃静置1 h。洗涤液洗板5 次。在每孔中加入酶标抗体工作液。 反应板37 ℃放置30 min。洗涤液洗板5 次。每孔加入基材工作液，置于37 ℃黑暗中15 min。 每孔加入终止液后，采用酶标仪（450 nm）测定OD 值，并计算最终标本浓度。

1.3 观察指标 采用双抗体夹心ELISA 法测定血清补体C5a、sCD163、HMGB1 水平。 本研究内所有研究对象均收集24 h 尿液（二甲苯防腐剂），采用全自动生活分析仪和免疫比浊法测定尿总蛋白浓度并计算24 h 尿蛋白水平。 采用间接免疫荧光法测定抗双链DNA 抗体（抗dsDNA）；采用比浊法测定补体C3、C4 水平。 采用系统性红斑狼疮疾病活动度评分表（SLEDAI）评价SLE 患者基本活动度。

1.4 统计学处理 采用SPSS 18.0 统计学软件分析数据，满足正态分布的计量资料采用（±s）表示，两样本独立t检验比较组间差异，单因素方差分析比较三组间差异，SNK-q 法比较三组两两组间差异；计数资料用率表示，采用χ2检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SLE 组患者与对照组的C5a、sCD163、HMGB1水平比较 SLE 组患者C5a、sCD163、HMGB1 水平明显高于对照组（P＜0.05），见表1。

表1 两组研究对象的C5a、sCD163、HMGB1 水平比较（±s）

表1 两组研究对象的C5a、sCD163、HMGB1 水平比较（±s）

组别对照组（n=35）SLE 组（n=71）t P C5a（ng/mL） sCD163（ng/mL）27.56±9.72 42.90±18.83 4.524 0.000 377.53±40.67 1 016.77±146.35 25.308 0.000 HMGB1（ng/mL）3.20±0.35 3.92±0.62 6.378 0.000

2.2 三组研究对象的C5a、sCD163、HMGB1 水平比较 活动组患者C5a、sCD163、HMGB1 水平明显高于无活动组、 对照组（P＜0.05）； 且无活动组患者C5a、sCD163、HMGB1 水平明显高于对照组 （P＜0.05）； 活动组患者SLEDAI 评分明显高于无活动组患者（P＜0.05）；见表2。

表2 三组研究对象的C5a、sCD163、HMGB1 水平比较（±s）

表2 三组研究对象的C5a、sCD163、HMGB1 水平比较（±s）

注：与对照组比较，*P<0.05；与无活动组比较，#P<0.05。

组别 C5a（ng/mL） sCD163（ng/mL） HMGB1（ng/mL） SLEDAI 评分（分）对照组（n=35）无活动组（n=28）活动组（n=43）F/t P 27.56±9.72 36.15±14.10*50.43±21.72*#18.908 0.000 377.53±40.67 614.38±52.66*1 169.19±87.59*#19.913 0.000 3.20±0.35 3.68±0.71*4.89±0.90*#28.973 0.000 2.72±0.37 11.36±2.87 15.805 0.000

2.3 三组研究对象的补体C3、C4、 抗dsDNA、24 h尿蛋白定量比较 活动组患者C3、C4 水平明显低于无活动组、对照组（P＜0.05）；活动组患者抗dsDNA、24 h 尿蛋白定量明显高于无活动组、 对照组（P＜0.05）；见表3。

表3 三组研究对象的补体C3、C4、抗dsDNA、24 h 尿蛋白定量比较（±s）

表3 三组研究对象的补体C3、C4、抗dsDNA、24 h 尿蛋白定量比较（±s）

注：与对照组比较，*P<0.05；与无活动组比较，#P<0.05。

组别 C3（g/L） C4（g/L） 抗dsDNA（IU/mL） 24 h 尿蛋白定量（g/24 h）对照组（n=35）无活动组（n=28）活动组（n=43）FP 1.37±0.48 1.10±0.40*0.82±0.36*#17.149 0.000 1.42±0.60 0.96±0.33*0.70±0.14*#22.452 0.000 243.51±43.39 324.64±62.19*362.55±82.73*#25.446 0.000 0.62±0.11 1.22±0.37*1.43±0.54*#26.391 0.000

2.4 SLE 组患者与对照组的C5a、sCD163、HMGB1水平ROC分析 C5a、sCD163、HMGB1 与三者联合检 测SLE 的AUC分 别 为0.778、0.824、0.782 及0.917（P＜0.05）；见表4 及图1。

图1 C5a、sCD163、HMGB1 诊断SLE 的ROC 曲线

表4 C5a、sCD163、HMGB1 诊断SLE 的ROC 特征

2.5 C5a、sCD163、HMGB1 水平与补体C3、C4、抗dsDNA、24 h 尿蛋白定量的相关性 C5a、sCD163、HMGB1 与补体C3、C4 呈负相关 （P＜0.05）；C5a、sCD163、HMGB1 与抗dsDNA、24 h 尿蛋白定量呈正相关（P＜0.05）；见表5。

表5 C5a、sCD163、HMGB1 水平与补体C3、C4、抗dsDNA、24 h 尿蛋白定量的相关性

2.6 C5a、sCD163、HMGB1 水平与SLEDAI 评分的相关性 C5a、sCD163、HMGB1 水平与SLEDAI 评分均呈正相关（P＜0.05），见表6。

表6 C5a、sCD163、HMGB1 水平与SLEDAI 评分的相关性

3 讨论

SLE 是一种常发生在年轻女性的自身免疫性炎症结缔组织疾病。 患者体内产生大量自身抗体增殖、活化。 HMGB1 在细胞外可介导炎症反应，在类风湿患者的关节液及狼疮性肾炎小鼠模型的肾组织中均发现HMGB1 异常增高[9]。 如不能及时发现SLE 的疾病活动，出现多系统损害，将严重影响患者的生活质量和生存率， 为社会和家庭带来巨大的负担。 故本研究观察并探讨了系统性红斑狼疮患者血清C5a、HMGB1、sCD163 水平变化及其临床意义，旨在为临床早期诊断、及时监测疾病活动度，控制病情提供帮助。

本研究结果显示，SLE 组患者C5a、sCD163、HMGB1 水平明显高于对照组；ROC曲线显示C5a、sCD163、HMGB1 及 三 者 联 合 检 测SLE 的AUC分别为0.778、0.824、0.782 及0.917。有学者研究报道， 健康对照组患者的血清C5a 水平显著低于SLE 患者[10]，且有研究发现，血浆C5a 水平可反映患者病情程度[11]；有研究学者以C5a 为靶点，补体C5a 单克隆抗体可有效治疗C5a 介导的炎症疾病[12]。 经治疗后的SLE 患者的血清sCD163 明显降低[13]。 SLE 患者的血清sCD163 明显多于正常健康组， 且其皮肤、 肾脏中CD163 巨噬细胞也明显增高；巨噬细胞也可直接参与炎症反应；这些结果提示表达异常的巨噬细胞表面标志物水平可能与SLE 的发病有关[14]。有研究报道，活动期患者HMGB1导致免疫系统攻击自身组织。 C5a 是一种包含74个氨基酸的糖蛋白， 具有过敏毒素样及趋化炎性因子的作用。 研究显示SLE 生物标志物C5a 参与SLE 发病过程，趋化炎症细胞向肾脏迁移，参与炎症反应[7]。 sCD163 是清道夫受体CD163 的脱落形式， 可溶于血清。 在炎性反应刺激下， 外周血sCD163 水平明显升高[8]，且能抑制T 淋巴细胞的水平明显高于健康对照组[15]，与本研究结果一致；报道内仍显示稳定期患者与健康对照组的HMGB1 水平无明显差异， 与本研究结果不一致，可能与样本数量或采集方法有关。 但仍提示临床C5a、sCD163、HMGB1 参与SLE 发病过程且在诊断SLE 上具有一定价值。

本研究结果显示， 活动组患者C3、C4 水平明显低于无活动组、对照组；活动组患者抗dsDNA、24 h 尿蛋白定量明显高于无活动组、对照组；C5a、sCD163、HMGB1 与 补 体C3、C4 呈 负 相 关；C5a、sCD163、HMGB1 水平与抗dsDNA、24 h 尿蛋白定量、SLEDAI 评分呈正相关。 狼疮肾炎是SLE 最普遍发生的并发症， 其诊断标准包括蛋白尿持续大于3＋，提示24 h 尿蛋白定量与肾炎发生有关。C3、C4 曾作为实验室评估SLE 活动的“金标准”，也较好反映SLE 的活动程度。 抗dsDNA 的存在对SLE的诊断价值非常大， 且狼疮肾炎特征之一为自身存在抗dsDNA。 故抗dsDNA 可作为反应疾病活动度及肾脏受累的指标。 既往研究显示，SLE 患者血清补体C5a 与SLEDAI 评分呈正相关[16]； 活动期SLE 患者血清C5a 水平与SLEDAI 评分的相关性高于C3 与SLEDAI 评分相关性[17]，结果提示，与补体C3 和C4 相比，C5a 可作为更敏感的SLE 疾病活动性指标。 HMGB1、C5a 水平与24 h 尿蛋白定量、 抗dsDNA 呈正相关，HMGB1 水平与补体C4呈负相关[18-19]，且国内外研究结果均显示狼疮肾炎发生与抗dsDNA 水平有关[20-21]，提示HMGB1 可能与抗dsDNA 抗体诱导的肾小球免疫复合物结合，进而在狼疮肾炎的发病机制中发挥作用。 既往研究结果与本研究结果一致， 提示HMGB1、C5a 与24 h 尿蛋白定量、抗dsDNA 同样可反映SLE 肾脏受累情况。 抗dsDNA 抗体≥800 IU/mL 的SLE 患者血清sCD163 水平明显升高，经治疗后SLE 患者SLEDAI 评分明显减少[22]。 同样提示血清sCD163具有一定评估SLE 严重程度的意义。

综上所述，C5a、sCD163、HMGB1 可作为诊断SLE 的重要指标；且C5a、HMGB1 可较好评估SLE疾病活动度及肾损伤；sCD163 能反映SLE 疾病严重程度。 本研究仅初步探讨了血清C5a、HMGB1、sCD163 水平在SLE 疾病不同活动度与健康对照组的变化，尚需进一步深入研究。