环介导等温扩增技术可视化快速检测表皮葡萄球菌方法的建立

李 冉，薛 晶，郭文平，康精萌，刘金霞

（承德医学院病原生物学实验中心，河北承德 067000）

医院内感染是影响住院患者原发病治疗效果和预后的重要危险因素。2014～2019年期间，我国医院内感染患病率为2.3%～2.7%，同期美国现患率为3.2%～4%，欧洲为5.9%[1,2]。葡萄球菌作为医院内感染的常见病原体，主要包括金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌[3]。表皮葡萄球菌，为条件致病菌，主要是通过粘附、定植在医疗器械表面，形成生物被膜，细菌培养和鉴定常常出现假阴性，导致病原学诊断难度加大[4,5]。因此，对表皮葡萄球菌感染的早期诊断和精准治疗至关重要。环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是一种等温核酸扩增，特异性和灵敏度较好，且不需要昂贵热循环设备[6,7]。基于此，本文针对表皮葡萄球菌SesB基因，建立改良的可视化LAMP反应体系，以期应用于感染者的早期快速诊断。

1 材料和方法

1.1 主要试剂

细菌DNA提取试剂盒、PCR试剂盒、6×Loading Buffer、D2000 Marker均购自北京天根生化科技有限公司；Bst2.0 DNA聚合酶购自New England BioLabs公司；甜菜碱和钙黄绿素购自Sigma公司；中性红试剂购自北京索莱宝科技有限公司。

1.2 菌株来源

表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）ATCC 12228；肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）BAA1705；甲型副伤寒杆菌（Salmonella para-typhi A）；耻垢分枝杆菌（Mycobacteria smegmatis）；金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）；肺炎链球菌（streptococcus pneumoniae）均为承德医学院病原生物学实验中心保存。

1.3 DNA提取

将表皮葡萄球菌ATCC 1228及各菌种分别接种至5 mL普通肉汤培养基中，摇床130 r/min，37 ℃培养18 h，得到菌悬液。根据细菌DNA提取试剂盒说明，提取各菌种的基因组DNA，应用核酸蛋白分析仪定量稀释为100 μg/μL，放置于-20 ℃冰箱保存。按以下公式计算拷贝数：拷贝数（copies/μL）=（ng数×10-9×6.02×1023）/（碱基对数×660）

1.4 引物设计

经查阅文献[8,9]，SesB基因为表皮葡萄球菌的特异性保守基因，针对SesB基因（GenBank：EF424054.1）选择特异性引物，并以LAMP的外引物为PCR反应引物，引物序列见表1。

表1 LAMP和PCR引物序列

1.5 LAMP反应标准体系

根据Bst2.0 DNA聚合酶说明说配置标准体系，10×缓冲液2.5 μL；10 mM的dNTPs溶液3.5 μL；5 M的甜菜碱溶液2 μL；100 mM的MgSO4溶液1.5 μL；40 μM的FIP/BIP各1 μL；5 μM的F3/B3各1 μL；Bst DNA聚合酶1 μL；DNA模版1 μL，无菌无酶水补足至25 μL。配置好的反应体系置于掌上离心机瞬时离心，向反应管中滴加20 μL液态石蜡油，封闭体系。以无菌无酶水代替DNA模板加入反应体系作为阴性对照，反应条件为恒温65 ℃，反应60 min后置于冰上终止反应。

1.6 PCR扩增体系和条件

反应体系包括：20 μM的引物F3、B3各1 μL；PCR Mix 12.5 μL；DNA模板1 μL，无菌无酶水补足至25 μL。PCR反应条件为：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30个循环；72 ℃ 5 min，扩增完成后于冰上终止反应。取5 μL扩增产物和1 μL Loading Buffer混合后，取5 μL加入2%琼脂糖凝胶孔中，水平电泳30 min后，置于凝胶成像分析仪观察条带。

1.7 LAMP可视化检测染料优化

1.7.1 钙黄绿素显色 在反应前，分别向配置好标准体系中加入终浓度为0.05 mM的钙黄绿素和终浓度为0.6 mM的氯化锰溶液后石蜡油封闭体系，65 ℃反应60 min，观察反应前后反应管颜色变化，阴性为淡橙色，阳性为浅绿色。

1.7.2 中性红显色 在反应前，向配置好的标准反应体系中加入终浓度为500 μM的中性红溶液后石蜡油封闭体系，65 ℃反应60 min，观察反应前后反应管颜色变化，阴性为橙黄色，阳性为红色。

1.7.3 浊度观察 配置标准反应体系，石蜡油封闭体系，65 ℃反应60 min，比较反应前后反应管浊度变化，阴性为澄清，阳性为浑浊。

1.8 LAMP体系优化

优化结果通过琼脂糖凝胶电泳和可视化两种方法呈现，并比较两种方法优化结果的一致性。

1.8.1 MgSO4优化 保持LAMP标准反应体系中其他条件不变，分别在反应体系中加入0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5 μL浓度为100 mM的MgSO4溶液，使其终浓度为0、2、4、6、8、10、12、14 mM，恒温65 ℃反应60 min。

1.8.2 甜菜碱优化 保持LAMP标准反应体系中其他条件不变，分别在反应体系中加入0、1、2、3、4、5、6、7 μL浓度为5M的甜菜碱溶液，使其终浓度为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 M，恒温65 ℃反应60 min。

1.8.3 温度优化 向反应体系中加入优化后的MgSO4浓度和甜菜碱浓度，保持LAMP标准反应体系中其他条件不变，分别在反应温度于59、61、63、65、67、69、71 ℃下反应60 min。

1.8.4 反应时间优化 向反应体系中加入优化好的MgSO4浓度和甜菜碱浓度，保持LAMP标准反应体系中其他条件不变，在最优反应温度下，分别反应20、30、40、50、60、70 min。

1.9 特异性评价

为确保反应体系的特异性，以表皮葡萄球菌ATCC 12228基因组DNA为阳性对照，副甲型伤寒杆菌、肺炎克雷伯菌、耻垢分枝杆菌、肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌基因组DNA为对比菌种，无菌无酶水为阴性对照组，对LAMP引物以及PCR引物特异性进行验证。

1.10 灵敏度评价

表皮葡萄球菌ATCC 1228基因组DNA使用核酸蛋白分析仪定量，稀释为1×104copies/μL后再依次进行10倍稀释，并以此系列DNA为模板进行LAMP和PCR反应，验证反应体系的灵敏度。

2 结果

2.1 LAMP可视化方法选择

钙黄绿素显色结果显示，反应后体系颜色由淡橙色变为绿色，反应前后颜色对比明显(图1C)。中性红作为pH指示剂显色结果显示，反应后体系由橙黄色变为橙红色，反应前后对比明显(图1B)。浊度比对结果显示，通过裸眼观察反应体系浊度变化不明显(图1A)。由于中性红在体系中易出现结晶影响观察，最终选择钙黄绿素作为可视化染料。

图1 不同类别染料的可视化结果比较

2.2 LAMP体系优化情况

MgSO4优化结果显示，当体系中MgSO4浓度为4 mM条带最亮，其次为6 mM，且当其终浓度超过6 mM时条带亮度逐渐降低（图2A、2B）；甜菜碱优化结果显示，当其终浓度为0.4 M时，条带最亮，甜菜碱添加量为1.4 M时条带亮度降低（图2C、2D）；温度优化结果显示，在61 ℃时，出现条带，当反应温度为63 ℃时，条带最亮，随反应温度升高条带亮度逐渐降低，且当反应温度达到71 ℃条带消失（图2E、2F）；时间优化结果显示，在50 min时出现特征性的梯状条带，60 min时条带的亮度较高且与70 min时条带亮度差别较小（图2G和图2H）。

图2 LAMP体系优化结果

2.3 LAMP检测体系特异性评价

LAMP和PCR两种检测方法均仅表皮葡萄球菌基因组DNA发生扩增，其他菌株均未发生扩增，且LAMP扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果与钙黄绿素可视化结果一致（图3）。

图3 特异性评价结果

2.4 LAMP检测体系灵敏度评价

当表皮葡萄球菌DNA浓度为10 copies/μL时，LAMP检测琼脂糖电泳仍出现特异性梯状条带，提示LAMP体系的最低检测限为10 copies/μL；PCR电泳结果图表明其最低检测限为100 copies/μL，LAMP的灵敏度比普通PCR高出10倍（图4）。

图4 灵敏度评价结果

3 讨论

表皮葡萄球菌常常导致心脏瓣膜感染、血流感染以及与假体关节等植入物感染，对患者的生命健康造成了严重的威胁[10,11]。在致病机制方面，与金黄色葡萄球菌不同的是表皮葡萄球菌只含有一种溶血肽δ-毒素，其感染通常是亚急性或慢性，早期临床表现不典型，因此，病原学诊断是临床医务工作者的瓶颈问题[11]。环介导等温扩增技术特异性强，灵敏度高，不需要专业的技术人员和检测设备，仅需要一个恒温水浴锅就可以完成检测，十分适宜在基层推广使用。并且，近年来研究人员通过控制气溶胶污染和染料的选择等方面对该技术不断改进，使其使用领域不断扩大。Kitajima等[12]将RT-LAMP检测新型冠状病毒（SARS-CoV-2）和RT-PCR比较，发现在SARS-CoV-2的诊断中，RT-LAMP在实用性上与RT-PCR一致，具有高度灵敏度和特异性，且RT-LAMP反应时间短、操作简单更适用于现场检测。本研究对LAMP检测表皮葡萄球菌的反应体系进行优化后，应用钙黄绿素染料对实验结果进行可视化，一步检测即可出结果，较适用于床旁或基层使用，且根据实验结果可以看出LAMP反应的灵敏度要比普通PCR高出10倍，操作也更加简单便捷。但是，因为LAMP反应的高灵敏度和反应扩增产物量巨大，需要十分注意LAMP扩增后核酸气溶胶造成实验室环境污染，引起假阳性的问题[13]；同时，像羟基萘酚蓝等染料需要在LAMP反应结束后加入，如若开盖也会增加核酸气溶胶污染的可能。为此，体系配置、核酸扩增和电泳要严格分区操作，也可在配置好的体系中滴加石蜡油，对反应体系进行封闭，减少污染问题的发生。除此之外，在体系反应前加入钙黄绿素、中性红等染料，可免除反应结束后揭盖再加入染料的步骤，既提高了反应的可视性，也可避免开盖后出现核酸气溶胶污染的问题。

LAMP反应有多种可视化方法，本研究比较了直接肉眼观察反应体系浊度的变化以及向体系中加入钙黄绿素或中性红染料观察反应前后体系颜色变化的三种方法。浊度改变主要是由于DNA扩增过程中产生的焦磷酸根可以与反应体系中的Mg2+结合形成沉淀，体系浊度发生改变，但是直接肉眼观察浊度改变并不是十分明显。中性红显色主要是依靠其pH指示剂的特性，由于DNA扩增中产生的氢离子使体系pH降低，使加入中性红的LAMP体系反应后，阴性为黄色，阳性为红色，颜色对比效果最明显[14]。实验过程中发现，中性红染料在反应后较容易出现结晶析出，导致结果观察不稳定。钙黄绿素显色主要是通过焦磷酸根竞争性结合Mn2+，使淬灭状态的钙黄绿素游离后显色，该法反应前向体系中加入钙黄绿素和氯化锰反应体系呈现淡橙色，反应后阳性为浅绿色，对比较明显[15]且反应后显色结果稳定易判断。因此，最终选择以钙黄绿素和氯化锰为可视化检测方法。

本研究建立了钙黄绿素可视化快速检测表皮葡萄球菌的LAMP反应体系。结果表明LAMP检测体系灵敏度高，特异性好，通过加入钙黄绿素染料，一步操作即可完成对病原体的检测，且不需要昂贵的检测仪器，适用且有望应用于基层及偏远贫困地区用于表皮葡萄球菌感染的早期诊断。