路路通益母膏质量控制方法改进研究*

易燕群，黄焕静，黄 相，童冰妮，麦志雄

（1.广西梧州制药（集团）股份有限公司，广西 梧州 543000；2.广西药物提纯工程技术研究中心，广西 梧州 543000）

路路通益母膏为广西梧州制药（集团）股份有限公司的独家生产品种，由人参、当归、黄芪、麦冬、益母草、郁金、路路通、通草及麦芽9味药材组成，具有补血养血、化瘀通络的功效，用于妇女产后血虚血瘀所致的缺乳[1]。现行标准建立了人参、麦冬、盐酸水苏碱、黄芪的鉴别及黄芪甲苷的含量测定方法；实际检测过程发现麦冬鉴别展开剂含苯等高毒性试剂，盐酸水苏碱的薄层鉴别供试品溶液制备方法步骤多，做完1批鉴别需要2～3 d。黄芪甲苷含量检验所用方法偏差率高。故本研究针对以上问题进行探索，对麦冬、盐酸水苏碱、黄芪的鉴别及黄芪甲苷的含量测定方法进行了改进优化，以便更好地对路路通益母膏进行质量控制。

1 仪器与材料

1.1 仪器 Agilent 1260液相色谱仪，配备Agilent 1260 ELSD检测器（美国Agilent公司）；XSE204电子分析天平（d=0.000 1 g）、XP56电子分析天平（d=0.001 mg）（梅特勒托利多公司）；KH-300PLUS全自动薄层色谱扫描仪（上海科哲生化科技有限公司）；Goodsee-20E薄层色谱成像系统（力扬企业有限公司）；HNY-500超声波清洗机（广州市华南超声设备有限公司）。

1.2 材料 高效硅胶G板（规格：100 mm×100 mm，生产日期：2022年4月7日）购自青岛海洋化工有限公司；薄层层析硅胶G（批号：02100328）购自青岛海洋化工有限公司；D101大孔吸附树脂购自西安蓝晓科技新材料股份有限公司；强酸性阳离子交换树脂（批号：Q164d1908010）购自广西梧州制药（集团）股份有限公司。乙腈为色谱纯，水为超纯水，其他试剂为分析纯。麦冬对照药材（批号：121013-201711）、黄芪对照药材（批号：121462-201705）、黄芪甲苷对照品（批号：110781-202118，含量：96.8%）、盐酸水苏碱对照品（批号：110712-201916，含量：99.2%）均购于中国食品药品检定研究院；路路通益母膏（批号：220301，220501，220601）为广西梧州制药（集团）股份有限公司提供。路路通益母膏阴性对照品：路路通益母膏（缺麦冬）、路路通益母膏（缺黄芪）及路路通益母膏（缺益母草）均称取处方药材减去对应的药材后按工艺制备而成。

2 方法与结果

2.1 麦冬鉴别

2.1.1 现行标准方法检验 取路路通益母膏（批号：220301，220501，220601）、麦冬对照药材以及按处方及制法制成缺麦冬的阴性对照样品，按现行标准方法麦冬薄层鉴别项下进行实验；薄层鉴别图谱可见阴性对照品与供试品和麦冬对照药材在相同位置均有一个墨绿色的斑点，说明该方法专属性差（见图1）。并且薄层展开剂为苯-丙酮（4∶1），苯为高毒性有机溶剂，具有致癌性，需要改良方法。

图1 路路通益母膏现行标准方法麦冬薄层鉴别图

2.1.2 新建立方法 取路路通益母膏10 g，用10 mL水溶解，溶液通过D101大孔吸附树脂柱（柱的直径为2 cm，高为18 cm）吸附，用水洗脱，直至流出的液体接近无色，再用80 mL质量分数为0.1%的NaOH溶液洗脱，再按顺序用以下不同浓度100 mL的乙醇溶液（30%、40%、50%）洗脱，弃去；再用120 mL的体积分数为60%的乙醇溶液进行洗脱并收集，蒸干，残渣用无水乙醇溶解制成1 mL的供试品溶液。阴性对照溶液由路路通益母膏（缺麦冬）称取10 g，按上述制备方法制成。称取麦冬对照药材约2 g，加水适量，回流提取1 h，趁热过滤，浓缩至20 mL，然后按上述方法制备成对照药材溶液。按照薄层色谱法（通则0502）试验，按下述条件进行试验：点样量为3～6 μL，点长条形；薄层板为高效硅胶G薄层板；展开剂为三氯甲烷-甲醇-水（26∶13∶4）10 ℃以下放置过夜的下层溶液，显色方式为喷以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃下加热2～5 min；检视方式为置紫外光灯365 nm下观察。图2的色谱图显示有2个亮蓝色的荧光斑点同时存在于供试品与对照药材溶液的相应位置上，阴性对照则没有这2个斑点，说明此方法分离度好，专属性强，可用于路路通益母膏的麦冬鉴别。

图2 路路通益母膏麦冬薄层鉴别图

2.2 黄芪鉴别

2.2.1 现行标准方法检验 取路路通益母膏（批号：220301，220501，220601）、黄芪对照药材、黄芪甲苷对照品及路路通益母膏（缺黄芪），按现行标准方法进行检验；图3显示供试品的图谱与对照药材及对照品在相应的位置上，日光灯及紫外光（365 nm）下均显相同颜色的斑点；路路通益母膏（缺黄芪）对鉴别无影响。

图3 路路通益母膏现行标准方法黄芪薄层鉴别图

2.2.2 新建立方法 取路路通益母膏5 g，精密称定，按乙肝宁颗粒含量测定供试品制备方法[2]，制备供试品溶液。取黄芪甲苷对照品适量用甲醇制成1 mg/mL的对照品溶液。取黄芪对照药材2 g，用水煎煮1 h，滤过，滤液水浴浓缩至10 mL，按供试品溶液的制备方法制成对照药材溶液。取路路通益母膏（缺黄芪）5 g，按供试品溶液的制备方法制成阴性对照溶液。按照薄层色谱法[2]进行试验，试验条件如下：点样方式条带状，对照品溶液点样量为5 μL，其他点样量为10～15 μL；薄层板为硅胶G薄层板；展开剂为三氯甲烷-甲醇-水（26∶13∶4）10 ℃以下放置过夜的下层溶液；显色方式为喷以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加热至斑点显色清晰，检视方式为日光及紫外光（365 nm）下观察。图4显示供试品的图谱与对照药材及对照品在相应的位置上，日光灯以及紫外光（365 nm）下均显相同颜色的斑点；路路通益母膏（缺黄芪）对鉴别无影响。

图4 路路通益母膏黄芪薄层鉴别图

2.3 盐酸水苏碱鉴别

2.3.1 现行标准方法检验 取路路通益母膏（批号：220301，220501，220601）、按处方及制法制成缺益母草的阴性对照样品以及盐酸水苏碱对照品，按现行标准方法盐酸水苏碱薄层鉴别项下进行实验，结果见图5。该检测方法的供试品溶液制备时采用硅藻土分散后回流提取与过中性氧化铝柱子纯化等步骤，步骤较多、繁杂，展开时间长，并且需要二次展开，检测周期需要3 d，检测周期长。

图5 路路通益母膏现行标准方法盐酸水苏碱薄层鉴别图

2.3.2 新建立方法 取路路通益母膏20 g，加乙醇50 mL，超声处理1 h，冷却后过滤，蒸干滤液，残渣加适量0.01 mol/L盐酸溶液溶解；通过已预处理好的强酸性阳离子交换树脂柱（内径为2 cm，柱高为15 cm）上，用纯化水洗至流出液近无色，再以氨试液80 mL洗脱，收集氨试液，蒸干，加甲醇溶解制成1 mL的供试品溶液。取路路通益母膏（缺益母草）20 g，按上述方法制成阴性对照溶液。取盐酸水苏碱对照品适量，加甲醇制成2 mg/mL的对照品溶液。按照薄层色谱[2]试验，试验条件如下：点样量为5～10 μL，为条状点样；薄层板为羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板；展开剂为丙酮-无水乙醇-盐酸（10∶7∶1）；显色方式为置于105℃条件下烘5～10min，放冷，再喷以新配置的稀碘化铋钾试液-1%三氯化铁无水乙醇溶液（1∶1）混合液；检视方式为日光下检视。图6显示有同一颜色的斑点同时存在于供试品与对照品溶液图谱的在相同位置上，阴性对照则无此斑点。该方法供试品溶液的制备操作简单，准确性高，检测周期大大缩短，薄层斑点明显，专属性、重现性好，可用于路路通益母膏的质量控制。

图6 路路通益母膏盐酸水苏碱薄层鉴别图

2.4 黄芪甲苷含量测定

杨力生急忙便说：“哦，相亲是好事，相亲是好事。不过，像妹子这么漂亮，心眼又好，无论如何也得找个称心如意的。可不能马马虎虎就跟人定下亲事。”

2.4.1 色谱条件 使用Inertisil ODS-3色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），以乙腈-水（32∶68）为流动相，流速为1.0 mL/min，柱温为25℃，进样体积为20 μL，蒸发光散射检测器检测，理论塔板数以黄芪甲苷计算不低于4 000。

2.4.2 对照品溶液的制备 精密称定黄芪甲苷对照品用甲醇制成1.018 3 mg/mL的储备液，备用。

2.4.3 供试品溶液的制备 取路路通益母膏5 g，精密称定，按“2.2.2”项供试品溶液制备方法制备，即得。

2.4.4 阴性对照溶液的制备 取路路通益母膏（缺黄芪）5 g，精密称定，按“2.2.2”项的供试品溶液制备方法制成阴性对照溶液。

2.4.5 方法学验证

2.4.5.1 系统适用性试验 分别精密吸取20 μL的黄芪甲苷对照品溶液、供试品溶液及阴性对照溶液，按“2.4.1”的色谱条件，进行试验。结果黄芪甲苷峰保留时间为12.83 min，分离度为4.8，理论塔板数为10 231；未见阴性对照品对试验有干扰。（见图7）

图7 系统适用性试验色谱图

2.4.5.2 线性关系考察 分别精密吸取储备液用甲醇稀释成含黄芪甲苷0.101 8、0.2037、0.3055、0.4073、0.5092、0.6110 mg/mL的系列对照品溶液。分别精密吸取上述对照品溶液20 μL注入液相色谱仪，按“2.4.1”色谱条件试验，绘制标准曲线以浓度对数为横坐标，峰面积对数为纵坐标，结果回归方程为：Y=1.58X+9.92；r=0.999 3；表明黄芪甲苷线性关系考察进样量2.036～12.220 μg与其对应的峰面积呈良好的Log-Log线性关系。

2.4.5.3 精密度试验 取路路通益母膏（批号：220501）按拟定方法制备供试品溶液，连续进样6次，计算6次的峰面积的相对标准偏差，结果黄芪甲苷峰面积RSD值为1.27%（n=6），表明该仪器的精密度良好。

取同一批路路通益母膏（批号：220501）4份，分别由甲、乙两人，于不同的时间，用同一台设备，按拟定的含量测定方法测定。结果黄芪甲苷含量的平均值为0.174 mg/g，RSD值为2.21%（n=4）。表明建立的含量测定方法精密度良好。

2.4.5.4 稳定性试验 取路路通益母膏（批号：220501），按“2.4.3”方法制备供试品溶液，按“2.4.1”色谱条件，在0～24 h内，每隔3 h进样测定1次，结果黄芪甲苷峰面积RSD值为3.61%（n=9），表明供试品溶液24 h内测定基本稳定。

2.4.5.5 重复性试验 取同一批路路通益母膏（批号：220501）6份，每份5 g，精密称定，按拟定的方法提取测定。结果含量平均值为0.168mg/g，RSD值为2.94%（n=6）。表明本法的重复性较好。

2.4.5.6 加样回收率试验 称取已知含量的路路通益母膏（批号：220501，含量：0.166 mg/g）6份，每份5 g，精密称定，分别精密加入1.0 mL黄芪甲苷对照品溶液（0.810 2 mg/mL），按“2.4.3”项供试品溶液制备方法提取，最终甲醇溶解定容至5 mL，摇匀，用0.45 μm滤膜过滤后按“2.4.1”项色谱条件测定，计算回收率。结果平均加样回收率为104.66%，RSD值为3.81%。表明本法符合定量分析的要求[3]。（见表1）

表1 加样回收率试验结果

2.4.5.7 耐用性 取同一供试品溶液（批号：220501），按拟定的测定法，分别用Inertsil ODS-3柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）、ACE Excel 5 C18-AR柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Waters Xbridge C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）3种品牌的色谱柱测定；结果黄芪甲苷含量平均值为0.169 mg/g，RSD值为3.86%。（见表2）

表2 黄芪甲苷含量测定-不同色谱柱比较

2.4.6 与现行标准方法比较 取路路通益母膏样品3批（批号：220301、220501、220601）分别按拟定方法及现行标准方法进行黄芪甲苷含量测定，结果见表3。本试验方法所测含量更高，准确性也更好，更适合用于路路通益母膏黄芪甲苷含量的测定。

表3 黄芪甲苷含量测定结果 （mg/g）

3 讨论

路路通益母膏现行标准中麦冬的薄层鉴别展开剂为苯和丙酮。本研究对麦冬鉴别的最初目的是寻找适宜的展开剂替换掉高毒性的苯，减少苯的使用。前期实验发现，改进的展开剂正己烷-乙酸乙酯（2∶1）也能满足鉴别需求，但进一步做阴性对照试验时发现，标准中的提取方式制备的供试品溶液无论是改进后还是标准的展开剂，结果都是阴性对照对鉴别有干扰。故本试验开展了麦冬鉴别全面的研究，尝试了多种薄层鉴别方法如麦冬药材药典方法[3]、甲醇提取后三氯甲烷萃取法[4]、酸性水溶液提取后三氯甲烷萃取法[5]、正丁醇萃取法[6]等均未达到专属性要求。麦冬中含有甾体皂苷[7-8]、高异黄酮[9-10]、多糖[11]、挥发油[12]等成分，甾体皂苷、高异黄酮和麦冬多糖具有多种药理活性[13-17]。本试验从提取纯化麦冬皂苷类成分[18]方向获得启发，根据路路通益母膏的性质改进了麦冬皂苷提取方式，获得了专属性好的2个荧光条带作为鉴别指标。

原标准中盐酸水苏碱鉴别的提取方式步骤较多，比较繁杂，并且展开剂展开时间长，还需二次展开，比较耗时。故本研究针对其提取方式和展开剂进行研究，拟修改其提取方式和展开剂，提高工作效率。有研究分别用中性氧化铝[19]，活性炭-中性氧化铝[20]、强酸性阳离子交换树脂[21]对样品进行纯化提取，结果发现中性氧化铝、活性炭-中性氧化铝过柱比较困难，而且薄层色谱图上未见待检成分的斑点。强酸性阳离子交换树脂提取得到的供试品溶液，其薄层色谱图上待检成分的斑点明显，重现性相对较好，操作简单，故本鉴别方法采用强酸性阳离子交换树脂进行纯化提取。在展开剂选择方面，本研究对正丁醇-盐酸-水、正丁醇-乙酸乙酯-盐酸、丙酮-无水乙醇-盐酸等体系进行了比较，结果以丙酮-无水乙醇-盐酸（10∶7∶1）效果最好。

目前文献报道的黄芪甲苷含量测定方法有薄层扫描法[22]、HPLC-ELSD[23]、UPLC-MS/MS[24]、HPLC-MS/MS[25]等方法。路路通益母膏现行标准的黄芪甲苷测定方式为薄层扫描，该方法目前手动操作比较多，人为的影响因素大，重现性不好，而且供试品溶液制备提取方式步骤较多，比较繁杂。本研究以2020年版《中华人民共和国药典》一部“黄芪药材含量测定”项和文献资料[26]为参考，根据实际情况进行研究，并进行了方法学考察。最终本研究确认了黄芪甲苷的HPLC-ELSD检测含量测定方法，该法准确性、重现性、可操作性均比薄层扫描法好。

本研究改进的方法专属性好、操作便捷，重复性好，比现行标准检验时间缩短了一半的检验时间，旨在提高检验效率，节约人工成本，同时也避免了高毒性溶剂苯及麻醉剂乙醚的使用，对环境污染、消防安全、职业健康做出了巨大的改善。