益气活血方对急性心肌梗死大鼠交感神经重构的影响*

杜天慧，郭书文，张宇沁，王 惠，陈 洁，李宇飞，张云舒，李欣怡，卢 洋

（1.北京中医药大学中医学院，北京 102400；2.北京中医药大学房山医院，北京 102400；3.北京中医药大学针灸推拿学院，北京 102400；4.北京中医药大学第三附属医院，北京 100020）

心肌梗死是最严重的心血管疾病之一，严重危害人类健康和生存质量。心肌梗死后心脏交感神经会发生形态学和功能学的不均一性重构，进一步加重心肌损伤，极易诱发恶性心律失常甚至心源性猝死[1]。因此减轻心肌梗死后交感神经重构，以降低各种恶性心律失常事件，成为学者们关注的热点和难点。一方面，心肌梗死后急性期内梗死边缘区交感神经过度再生，分布呈不均一性改变；另一方面交感神经过度兴奋及支配不对称性将进一步导致高支配区与正常区域和去支配区域形成神经肽等神经递质的浓度差异，极易诱发心律失常[2]。急性心肌梗死发生后，神经营养因子在心肌局部或心脏循环中表达增加，在神经重构中发挥重要作用，尤以梗死边缘区明显[3]。心肌梗死后交感神经系统被激活，释放大量的神经肽Y（neuropeptide Y, NPY），可强烈收缩冠状动脉，增强交感神经重构，同时血小板聚集会加重心肌缺血，诱发心律失常[4]。酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase, TH）阳性表达可反映交感神经再生情况。多项研究表明，生长相关蛋白43（growth associated protein-43, GAP43）和神经生长因子（nerve growth factor, NGF）可促进神经元的增殖分化，NGF浓度和神经再生密度呈正相关[5]。神经抑制因子信号素3A（semaphorin 3A, Sema-3A）可通过引起神经元生长锥塌陷，发挥避免神经过度生长和神经纤维在局部聚集的作用[6]。

益气活血方是郭书文教授的经验用方，由李东垣《内外伤辨惑论》当归补血汤加减化裁而来，具有补气生血、益气活血之效。方中益气药剂量高于活血药。临床中益气活血方与西药联合应用，可明显改善心肌缺血患者心肌供血、左心功能及相应临床症状[7]。

急性心肌梗死发生后心脏神经的改变于早期即可出现。本研究从神经重构入手，观察急性心肌梗死后早期益气活血方对心脏神经的影响作用，旨在为益气活血方减轻心肌梗死损伤提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物 6～8周龄SPF级健康雄性SD大鼠92只，体质量200～220 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证编号：SCXK（京）2020-0033。大鼠饲养于北京中医药大学SPF级动物房，自由摄食饮水，依昼夜节律12 h光照/12 h黑暗，室温24～26 ℃，相对湿度40%～70%。本实验通过伦理审查，编号：BUCM-4-2021110806-4070。

1.2 药物制备 益气活血方（专利号：201610368030.7）组成：黄芪50 g，当归15 g，生晒参10 g，川芎15 g，三七6 g。中药购于北京中医药大学东直门医院，经付鹏（中药学专业，副主任药师）鉴定审查。根据课题组前期研究[8]药物剂量比和煎煮方法制备。煎煮后过滤，浓缩，分装，灭菌后备用。

酒石酸美托洛尔片（阿斯利康制药有限公司，25 mg/片，批号：1805A23）。

1.3 主要仪器与试剂 小动物呼吸机（成都泰盟软件有限公司，型号：HW-101E）；高分辨小动物超声影像仪（加拿大Vusual Sonics公司，型号：Vevo2100）；制冰机（日本SANYO公司，型号：SIM-00083）；石蜡冷冻包埋机（中国金华科迪公司，型号：KD-BM）；复式脱色摇床（海口市其林贝尔仪器制造有限公司）；全波长荧光酶标仪（瑞士Tecan公司，型号：Safire2）；精密电子天平（德国Sartorius公司，型号：BAS223S）；蛋白质电泳系统（北京市六一仪器厂）。4%多聚甲醛固定液（赛维尔公司，批号：G1101-500ML）；戊巴比妥钠（上海曦耀生物科技有限公司，批号：Y2019012102）；注射用青霉素钠（华北制药股份有限公司，批号：F6032104）；NGF抗体（批号：ab52918）、GAP43抗体（批号：ab75810）、Sema-3A抗体（批号：ab23393）、TH抗体（批号：ab112）、Actin内参抗体（批号：ab8226）均购自美国Abcam公司；标记山羊抗小鼠辣根过氧化物酶（批号：Sc-2005）、标记山羊抗兔辣根过氧化物酶（批号：Sc-2004）均购自美国Santa Cruz公司；PVDF膜（德国Millipore公司，批号：03010040001）；ECL发光液（赛默飞公司，批号：34080）；大鼠神经肽Y酶联免疫吸附测定试剂盒（武汉伊莱瑞特公司，批号：E-EL-R0655c）。

1.4 模型建立 92只大鼠随机选取20只作为假手术组，余72只行左冠状动脉前降支结扎术。1%戊巴比妥钠腹腔注射（40 mg/kg）麻醉后固定大鼠，备皮。气管插管成功后连接小动物呼吸机。在严格无菌条件下行左冠状动脉前降支结扎术。于左侧第三、四肋间逐层横向剪开皮肤和肌肉，钝性分离心包膜，以合适视野充分暴露心脏，于左心耳与肺动脉圆锥间下2 mm进针结扎前降支，结扎完毕后迅速逐层缝合，撤掉呼吸机后密切关注大鼠是否恢复节律性自主呼吸，同时注意保暖复温。术后每只大鼠立即注射利多卡因0.1 mL防止心律失常，呋塞米0.1mL减轻心脏负荷，连续3 d注射青霉素（20万U/d）预防感染。术后心电图显示3个连续坏死性q波提示造模成功。假手术组造模过程同上，仅穿线不结扎。60只大鼠造模成功，成功率83.33%（60/72）。

1.5 动物分组及给药 将60只造模成功大鼠随机分为模型组、益气活血方组、美托洛尔组，各20只。每组两个观察时间点各10只。手术后24 h起每日在同时间段内各组大鼠灌胃1次，连续给药7 d。中药依据临床等效生药剂量按大鼠和人6∶1换算。成人体质量70 kg每日生药量为96 g。96 g/70 kg×6=8.2 g/（kg·d）。给药剂量为：美托洛尔组0.5 mg/（kg·d），益气活血方组8.2 g/（kg·d）[9]，假手术组和模型组给予等体积蒸馏水，1.0 mL/（kg·d）。

1.6 观察指标

1.6.1 心功能 给药后3、7 d，1%戊巴比妥钠腹腔注射（40mg/kg）麻醉后固定大鼠，备皮,超声高频探头RMV716取左心室短轴切面，通过M型曲线进行超声检查。每只取3个心动周期，计算平均值：左心室短轴率（left ventricular fractional shortening,LVFS）、左心室射血分数（left ventricular ejection fraction,LVEF）、左心室收缩末期内径（left ventricular internal dimension systole, LVIDs）和左心室舒张末期内径（left ventricular end diastolic diameter, LVIDd）均值。

1.6.2 室颤阈值 给药后3、7 d，大鼠麻醉后固定，备皮，气管插管，无菌条件下开胸充分暴露心脏，连接电极后将刺激电极的正极插于左心室心尖部组织，负极插入左室前壁右侧，接近梗死区位置，正负极距离约0.3 cm，电极插入组织深度约0.1 cm。将电刺激条件设定为：方波、串刺激（每串刺激10个刺激波，脉宽ms），初始电压1 V，每隔30 s递增1 V，刺激频率30 Hz[10]。记录室颤阈值。

1.6.3 心肌病理变化 心肌取材时间点为给药后3、7 d。取材前禁食12h，1%戊巴比妥钠腹腔注射（40 mg/kg）麻醉。取腹主动脉血，于严格无菌条件下取出心脏，置于冷生理盐水中充分洗去残留血液，于冰上将组织横切为上下两个部分。上半部固定后用于石蜡包埋、切片、染色；下半部剪取梗死边缘区后迅速浸入液氮保存，用于蛋白检测。上半部组织固定24 h后包埋、切片。将切片脱蜡复水，Harris苏木素染核，流水冲洗，梯度乙醇脱水；1%乙醇伊红染色，乙醇梯度脱水，二甲苯透明，中性树脂封片，使用显微镜观察拍照。

1.6.4 TH阳性交感神经纤维分布 采用免疫组化观察TH阳性交感神经纤维分布情况。石蜡切片脱蜡至水后滴加内源性过氧化物酶阻断液，室温孵育20 min，PBS缓冲液水洗3次，5 min/次，置于EDTA抗原修复缓冲液中，蒸锅内进行抗原修复8 min。冷却至室温后划圈，滴加血清封闭37 ℃，30 min后甩去多余血清后加入一抗，将切片平放于湿盒内4 ℃孵育过夜；PBS洗涤3次，5 min/次，加入二抗室温孵育1 h。PBS洗涤3次，5 min/次，滴加DAB液显色，显微镜下观察控制显色时间后置于蒸馏水终止反应，水洗后烘干。苏木素复染40 s，水洗，返蓝液浸泡1 min，再水洗。乙醇梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，扫描。

1.6.5 大鼠血浆NPY含量 采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测大鼠血浆NPY含量，观察心脏交感神经被激活情况。根据试剂盒说明测定OD值检测血浆NPY含量。

1.6.6 神经重构相关因子的蛋白表达 采用免疫印迹法（Western blotting）检测大鼠梗死心肌边缘区NGF、GAP43、Sema-3A、TH蛋白相对表达量。提取样品蛋白，BCA试剂盒测定样品浓度后调整各组蛋白为同等浓度，加入上样缓冲液后煮沸5 min使蛋白变性。分别制作分离胶和浓缩胶，蛋白上样，电泳，浓缩胶恒压100 V 20 min，分离胶恒压120 V，电泳直至溴酚蓝到凝胶底部后电转，将凝胶上蛋白表达转膜至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，恒流200 mA，时间为2 h，转膜后将PVDF膜在封闭液中封闭60 min，加入1∶500稀释后的一抗，4 ℃孵育过夜。回收一抗后TBST洗膜3次，10 min/次，室温下加入对应二抗，摇床孵育60 min，TBST洗膜5次，5 min/次，最后滴加ECL显色液，曝光。运用Image-J软件定量蛋白条带灰度，分析得到蛋白相对表达量。

1.7 统计学方法 采用SPSS 26.0软件分析数据，计量资料用“均数±标准差”（）表示。经检验所有资料符合正态分布，进行方差齐性检验。若方差齐，采用单因素方差分析，多重比较采用LSD分析，若方差不齐，采用盖姆斯-霍威尔（Games-Howell）分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠心功能比较 给药3、7d，模型组大鼠LVEF、LVFS均低于假手术组，LVIDd、LVIDs均高于假手术组，差异均有统计学意义（P＜0.01）。给药3 d，益气活血方组、美托洛尔组大鼠LVEF、LVFS、LVIDd与模型组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；益气活血方组大鼠LVIDs低于模型组（P＜0.05）。给药7 d，益气活血方组和美托洛尔组大鼠LVEF、LVFS均高于模型组（P＜0.05或P＜0.01），LVIDs均低于模型组（P＜0.05)；益气活血方组和美托洛尔组大鼠LVIDd与模型组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。美托洛尔组整体疗效优于益气活血方组，但个体差异较大，美托洛尔组大鼠给药7 d后的LVIDs低于给药3 d（P＜0.05）；益气活血方组个体差异较小疗效更加稳定。（见表1）

表1 各组大鼠心功能比较 （）

表1 各组大鼠心功能比较 （）

注：与假手术比较，aP＜0.01；与模型组比较，bP＜0.05，cP＜0.01；与给药3 d比较，dP＜0.05。

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2.2 各组大鼠电刺激诱发室颤阈值比较 给药3、7 d，模型组大鼠电刺激诱发室颤阈值低于假手术组（P＜0.01或P＜0.05）；给药3 d，益气活血方组、美托洛尔组大鼠电刺激诱发室颤阈值与模型组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。给药7 d，美托洛尔组大鼠电刺激诱发室颤阈值高于模型组（P＜0.01）；益气活血方组大鼠电刺激诱发室颤阈值与模型组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。美托洛尔组大鼠给药7 d后电刺激诱发室颤阈值高于给药3 d（P＜0.05）。（见表2）

表2 各组大鼠电刺激诱发室颤阈值比较 （，V）

表2 各组大鼠电刺激诱发室颤阈值比较 （，V）

注：与假手术比较，aP＜0.01，bP＜0.05；与模型组比较，cP＜0.01；与给药3 d比较，dP＜0.05。

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2.3 心肌病理变化 假手术组大鼠心肌细胞排列整齐无明显改变，仅见少量炎症细胞；模型组大鼠心肌细胞断裂且排列紊乱，细胞形态不规则，细胞核发生固缩，间隙明显变大，心肌纤维杂乱无序，且明显存在大量炎症细胞浸润。给药3 d后，益气活血方组和美托洛尔组大鼠心肌细胞结构紊乱，部分坏死，但细胞间间隙减小，炎症纤维减少。给药7 d后，益气活血方组大鼠较模型组改善明显，炎症细胞浸润明显减少，心肌细胞排列较为整齐；美托洛尔组大鼠心肌细胞排列有明显整齐改变，但仍可见炎症细胞浸润和心肌纤维增生。（见图1）

图1 心肌组织病理改变 （HE，×50，标尺=200 μm）

2.4 TH阳性交感神经纤维分布 假手术组大鼠心肌细胞走行方向一致，TH阳性神经纤维少见。模型组大鼠TH阳性神经纤维密度明显增加，分布紊乱，形态粗大不一，甚者聚集呈束。给药3 d，益气活血方组、美托洛尔组大鼠TH阳性神经纤维密度低于模型组，且形态分布逐渐向正常改变，但仍可见大量炎症细胞；给药7 d，益气活血方组、美托洛尔组大鼠神经形态及分布趋于正常化，聚集及粗大的神经纤维较少见。益气活血方组大鼠TH阳性神经纤维少于美托洛尔组，心肌细胞走行更均匀一致。（见图2）

图2 TH 阳性交感神经纤维分布 （免疫组化，×100，标尺=100 μm）

2.5 各组大鼠血浆NPY含量比较 给药3、7 d，模型组大鼠血浆NPY含量高于假手术组，差异有统计学意义（P＜0.01）；益气活血方组大鼠血浆NPY含量与美托洛尔组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。给药3 d，益气活血方组、美托洛尔组大鼠血浆NPY含量与模型组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。给药7 d，益气活血方组、美托洛尔组大鼠血浆NPY含量均低于模型组（P＜0.01）。益气活血方组、美托洛尔组大鼠给药7 d后的血浆NPY含量均低于给药3 d（P＜0.01）。（见表3）

表3 各组大鼠血浆NPY 含量比较 （，pg/mL）

表3 各组大鼠血浆NPY 含量比较 （，pg/mL）

注：与假手术比较，aP＜0.01；与模型组比较，bP＜0.01；与给药3 d比较，cP＜0.01。

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2.6 各组大鼠梗死心肌边缘区NGF、GAP43、Sema-3A、TH蛋白相对表达量比较 给药3、7 d，模型组大鼠NGF、GAP43、TH蛋白相对表达量均高于假手术组，Sema-3A蛋白相对表达量低于假手术组，差异均有统计学意义（P＜0.01）；益气活血方组、美托洛尔组大鼠NGF、GAP43、TH蛋白相对表达量均低于模型组，Sema-3A蛋白相对表达量均高于模型组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。给药3 d，益气活血方组大鼠NGF蛋白相对表达量高于美托洛尔组（P＜0.05）。给药7 d，益气活血方组大鼠TH蛋白相对表达量高于美托洛尔组（P＜0.05）；益气活血方组大鼠其余指标与美托洛尔组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。各组大鼠给药7 d各指标与给药3 d比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。（见表4、图3）

图3 NGF、GAP43、Sema-3A、TH 蛋白表达Western blotting 图

表4 各组大鼠梗死心肌边缘区NGF、GAP43、Sema-3A、TH 蛋白相对表达量比较 （）

表4 各组大鼠梗死心肌边缘区NGF、GAP43、Sema-3A、TH 蛋白相对表达量比较 （）

注：与假手术比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与美托洛尔组比较，cP＜0.05；与给药3 d比较，dP＞0.05。

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3 讨论

心肌梗死属中医“胸痹”“心痛”范畴中的“真心痛”。张仲景在《金匮要略》中首次提出其病机为“阳微阴弦”。心主血脉，心脉痹阻不通则见心烦胸痛、脉急善恐等症。血脉运行赖心阳推动。心阳不足，鼓动无力，则见气滞血瘀，血脉不通。益气活血方是郭书文教授治疗心肌梗死的经验用方，临床应用收效显著。方中黄芪、人参益气固本；当归、川芎、三七行气活血，促进气血的动态平衡和相互滋养。课题组前期研究[11-14]发现，益气活血方可有效恢复心肌梗死后大鼠的冠脉微循环障碍，减轻心肌梗死后炎症和氧化应激，抑制心肌细胞凋亡和坏死，改善左心室功能，降低心肌梗死后心衰、心律失常发生率。本研究拟通过观察心肌梗死后交感神经重构具体情况，探究益气活血方降低心律失常的作用机制。

心肌梗死后同区域交感神经损伤、坏死、重构及过度再生，会导致神经对心肌活动支配不均一，极易引起心脏电传导紊乱，是导致心律失常重要机制之一[15]。机体损伤后首先会发生自我修复反应，即心肌梗死后早期出现交感神经适度再生。但随着疾病进展，神经过度再生常常刺激交感神经系统激活，是造成心源性猝死和恶性心律失常的主要因素之一。研究发现中药复方可通过调节神经内分泌过度激活，延缓心肌细胞凋亡[16]。

本实验发现使用益气活血方和美托洛尔干预急性心肌梗死大鼠3 d后，LVIDd有回缩趋势，心功能一定程度恢复；干预7 d后，心功能明显恢复，室颤阈值明显升高，心肌细胞恢复良好。从时间跨度上看，益气活血方组疗效变化大于美托洛尔组，且疗效均一性良好，个体差异小于美托洛尔组。以上结果表明急性期（3 d）美托洛尔对于心肌梗死后恢复具有较好优势。美托洛尔可有效降低心律失常，阻断或延缓心肌重塑[17]。中药的多靶点综合治疗作用持久，恢复心功能、降低心律失常发生率的疗效更明显[18]。

心肌梗死后早期即可出现神经重构。有研究[19]指出，心肌梗死大鼠再生的神经纤维大多呈TH阳性，表明再生神经以成熟的交感神经为主，且心肌组织中TH阳性交感纤维的分布和密度可反映神经重构状态。本研究结果表明，心肌梗死后梗死边缘区TH阳性神经纤维密度明显增加且分布不规则，神经纤维形态变形粗大。经药物治疗后，TH阳性神经分布和密度均减少，形态走行趋于规律正常。其中，给药7 d后，益气活血方组阳性神经纤维明显少见，心肌细胞走行均匀一致，表明益气活血方在心肌梗死早期可有效抑制交感神经重构。

心脏受多种肽能神经支配[20]，益气活血方可能通过有效抑制去甲肾上腺素释放发挥心肌保护作用[21]。本研究中NPY作为一种非肾上腺素能、非胆碱能神经递质，在心肌梗死后能够很好地反映交感神经活性及交感神经递质释放的动态变化[22]。给药7 d后，益气活血方和美托洛尔可有效抑制NPY的释放，且给药3 d时益气活血方组疗效比美托洛尔更明显。NGF可促进机体神经元生长、增殖和分化，该水平与神经生成呈正相关[23]。GAP43在成熟或稳定神经元中以不表达或低表达方式存在，但在神经系统发育或再生时期GAP43与NGF可迅速增高，标志着相关神经快速生长[24-25]。在部分神经系统发育中，Sema-3A是协助改善交感神经重构的相关因子。其通过抑制交感神经再生从而防止神经发生过度发育与支配[26]，在心肌梗死后发挥维持心脏自主神经平衡的重要作用。心肌梗死急性期即可发生神经重构，而早期益气活血方疗效与美托洛尔相当，两者均可以下调GAP43、NGF、TH表达，上调Sema-3A表达，尤以给药7 d后效果更为明显，提示益气活血方在心肌梗死急性期可能通过调节神经因子表达水平有效改善交感神经重构状态。

综上所述，益气活血方可能通过抑制心肌梗死急性期交感神经系统激活，进而抑制NPY分泌，下调神经因子水平，降低室颤阈值。本研究结果表明，早期美托洛尔疗效更佳但个体差异明显，益气活血方早期可发挥疗效且均一性良好，提示临床上在急性期可进行尽早干预，中西药联合使用，抑制交感神经重构，降低恶性心律失常发病率。