木犀草苷抑制SNHG14表达改善SW1353骨关节炎细胞模型的实验研究*

王晓戈，张靖笛，李 月，田林强

（新乡医学院第三附属医院创伤与骨科研究所，河南 新乡 453000）

骨关节炎（osteoarthritis，OA）是最常见的肌肉骨骼系统疾病，是导致老年人残疾和生活能力丧失的常见原因。OA病理特征是软骨退变和丢失、软骨下骨损伤和硬化，主要以行动受限及关节疼痛为主要临床症状[1]。研究[2]表明，在发达国家中OA产生了较大的经济负担，其治疗费用占国内生产总值的1.0%～2.5%。目前骨关节炎传统的治疗主要包括健康教育、疼痛管理、药物治疗和手术治疗[3-4]。

长链非编码RNA（lncRNA）在表观遗传等多种层面上对靶基因调控，从而发挥调节细胞分化、增殖和凋亡等作用[4]。研究发现，lncRNA SNHG14能通过刺激miR-4673调节细胞因子信号传导抑制因子1（suppressor of cytokine signaling 1，SOCS1）表达，从而促进肝癌细胞的增殖和抑制凋亡[5]。但是，lncRNA SNHG14在骨关节炎中的作用尚未见报道。

木犀草苷(Cynaroside, Cy)，是植物中广泛存在的一种黄酮苷类化合物[3]。Cy具有抗肿瘤[6]、抗炎[7]、抗糖尿病[8]和抗氧化[9]等药理活性。研究[10]表明，Cy是能够发挥抗炎作用的主要化合物之一，但Cy对人软骨细胞的保护作用尚未见报道。因此，本研究在体外构建骨关节炎细胞模型，并探讨Cy对骨关节炎细胞模型的保护作用及其可能的机制，旨在为临床治疗提供新的药物选择。

1 材料

1.1 实验药物及细胞 木犀草苷（批号：SC8790）购自北京索莱宝公司；SW1353人软骨肉瘤细胞系（GDC0621）由新乡医学院生命科学学院王磊教授惠赠。

1.2 主要试剂与仪器 高糖DMEM培养基（批号：AD1002）购自河南省普诺易生物制品研究院有限公司；胎牛血清（批号：16140089）购自购自美国赛默飞世尔科技公司；0.25%胰蛋白酶（批号：C125C1）购自新赛美生物科技有限公司；PBS缓冲液（批号：BL302A）购自兰杰柯科技有限公司；白细胞介素-1β（IL-1β）（批号：200-01B）购自美国派普泰克生物科技有限公司；反转录试剂盒（批号：KR116-02）、荧光定量试剂盒（批号：FP209-02）购自天根生化科技有限公司；无水乙醇（批号：20201112）购自天津市德恩化学试剂有限公司；RIPA裂解液（批号：P0013B）购自碧云天生物技术有限公司；羊抗兔一抗基质金属蛋白酶13（MMP13）（批号：39012）、兔抗人一抗二型胶原（COL2a1）（批号：Ab34712）、兔抗人一抗聚集蛋白聚糖（ACAN）（批号：Ab194594）均购自美国Abcam公司；二抗辣根过氧化物酶标记山羊抗鼠IgG（批号：7076S）、二抗辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG（批号：7074S）、兔抗人一抗GAPDH（批号：2118S）均购自美国Cell Signaling Technology公司；CCK8试剂盒（批号：C0042）购自中国碧云天生物技术有限公司。Multiskan酶标仪（赛默飞世尔科技公司）；电泳仪（上海伯乐生命医学产品有限公司）、Real-Time PCR仪（Roche lightcycler 480）；培养箱（37 ℃，5%CO2）（中国赛默飞世尔科技有限公司）；化学发光仪（上海勤祥科学仪器有限公司）；倒置显微镜（德国徕卡生物系统有限公司）。

2 实验方法

2.1 SW1353细胞培养 将SW1353细胞置于含10%胎牛血清及双抗的高糖DMEM完全培养基中，并放置于37 ℃、5% CO2培养箱中进行培养。取对数生长期细胞进行后续实验。

2.2 Cy溶液配制 将Cy（20 mg）用1 mL培养基进行溶解，配置成20 mg/mL母浓缩液，放置于-20 ℃冰箱储存，工作液现用现配。

2.3 CCK-8检测细胞毒性 取对数生长期的SW1353细胞接种于96孔板中，每孔加入1×105个细胞，当80%～90%细胞贴壁后给予0.1%二甲基亚砜（DMSO）及不同浓度（0、10、20、30、40、50μmol/mL）的Cy处理24 h。在每孔加入CCK-8试剂10 μL继续培养2 h，用酶标仪测量450 nm波长的OD值。

2.4 实验分组 确定Cy及IL-1β的干预浓度后，将SW1353细胞分为4组。（1）正常对照组：SW1353细胞不进行任何处理；（2）IL-1β组：采用10 ng/mL IL-1β处理SW1353细胞24 h；（3）木犀草苷低剂量组：采用10 ng/mL IL-1β+10 μmol/mL Cy处理SW1353细胞24 h；（4）木犀草苷高剂量组：采用10 ng/mL IL-1β+20 μmol/mL Cy处理SW1353细胞24 h。

2.5 RT-qPCR 检测MMP-13 mRNA、IL-6 mRNA、COL2a1 mRNA、ACAN mRNA、SNHG14 mRNA表达水平 取对数生长期SW1353细胞接种于6孔板中，按照“2.4”分组处理。收集各组细胞，采用Trizol法进行细胞总RNA的提取，以10 cm皿为例加入Trizol 1 mL孵育3～5 min；加入200 μL氯仿剧烈震荡，充分混匀。采用Multiskan酶标仪检测RNA的浓度及纯度；使用Fastking RT kit（with gDNase）试剂盒将总RNA反转录合成cDNA；将合成的cDNA作为模板进行实时荧光定量，实时荧光定量PCR反应程序如下，95 ℃3 min，95 ℃10 s，60 ℃10 s，循环40次。将所得的结果采用2-ΔΔCt法进行分析。所使用的引物均由上海生物工程有限公司合成。目的基因引物序列见表1。

表1 PCR 引物序列

2.6 Western blotting检测MMP-13、COL2a1、ACAN蛋白表达取对数生长期SW1353细胞接种于6孔板中，按照“2.4”分组处理。收集各组细胞，采用RIPA试剂将细胞进行裂解，BCA蛋白定量试剂盒进行定量，提取SW1353细胞的总蛋白，选取1.0 mm的孔进行加样，每孔上样量为10 μL，经SDS-PAGE电泳1.5 h，转膜至甲醇浸泡过的PVDF膜，转膜2.5 h，之后采用5%脱脂奶粉封闭1 h，敷单克隆兔抗人一抗（1∶1 000）4 ℃冰箱摇床过夜。T-BST洗膜30 min（3次），室温加入辣根过氧化物标记的酶二抗孵育（1∶10 000）1 h，T-BST洗膜30 min（3次），化学发光成像显影。将所得结果采取ImageJ进行分析整理。

2.7 统计学方法 采用SPSS 26.0软件进行统计学分析，计量资料均符合正态分布且满足方差齐性，计量资料采用“均数±标准差”（）表示，多组比较采用单因素方差分析，多重比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 不同浓度的Cy对SW1353细胞活性的影响 与正常对照组比较，10、20 μmol/mL Cy处理24 h后SW1353细胞活性明显增强（P＜0.05），50 μmol/mL Cy可明显抑制细胞活性（P＜0.01）。所以后续实验采用木犀草苷（Cy）浓度10、20 μmol/mL进行。（见图1）

图1 CCK-8 检测不同浓度Cy 对SW1353 细胞活性的影响（，n=3）

3.2 各组SW1353细胞MMP-13 mRNA、IL-6 mRNA、ACAN mRNA、COL2a1 mRNA相对表达量比较 IL-1β组MMP-13 mRNA、IL-6 mRNA相对表达量高于正常对照组，ACAN mRNA、COL2a1 mRNA相对表达量低于正常对照组，差异均有统计学意义（P＜0.01）；Cy低、高剂量组MMP-13 mRNA、IL-6 mRNA相对表达量低于IL-1β组，ACAN mRNA、COL2a1 mRNA相对表达量高于IL-1β组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。表明IL-1β诱导处理SW1353细胞能提高MMP-13 mRNA、IL-6 mRNA表达，抑制胞外基质ACAN mRNA、COL2a1 mRNA表达，且经Cy处理能逆转这一现象。（见图2）

图2 各组SW1353 细胞MMP-13 mRNA、IL-6 mRNA、ACAN mRNA、COL2a1 mRNA 相对表达量比较 （，n=3）

3.3 各组SW1353细胞lncRNA SNHG14 mRNA相对表达量比较 IL-1β组lncRNA SNHG14 mRNA表达水平高于正常对照组，差异有统计学意义（P＜0.01）；Cy低、高剂量组lncRNA SNHG14 mRNA表达水平低于IL-1β组，差异有统计学意义（P＜0.01）。表明IL-1β诱导处理SW1353细胞能提高lncRNA SNHG14 mRNA表达，且经Cy处理能逆转这一现象。（见图3）

图3 各组SW1353 细胞lncRNA SNHG14 mRNA相对表达量比较 （，n=3）

3.4 各组SW1353细胞MMP-13蛋白相对表达量比较 IL-1β组MMP-13蛋白相对表达量高于正常对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；Cy低、高剂量组MMP-13蛋白相对表达量低于IL-1β组，差异均有统计学意义（P＜0.01）。表明经IL-1β诱导处理SW1353细胞能提高MMP-13蛋白表达水平，且经Cy处理能逆转这一现象。（见图4～5）

图4 各组SW1353 细胞MMP-13、ACAN、COL2a1 蛋白表达Western blotting 图

图5 各组SW1353 细胞MMP-13、ACAN、COL2a1 蛋白相对表达量比较 （，n=3）

3.5 各组SW1353细胞外基质ACAN、COL2a1相对表达量比较 IL-1β组细胞外基质ACAN、COL2a1蛋白相对表达量低于正常对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；Cy低、高剂量组细胞外基质ACAN、COL2a1蛋白相对表达量高于IL-1β组，差异均有统计学意义（P＜0.01）。表明经IL-1β诱导处理SW1353细胞能降低细胞外基质ACAN、COL2a1蛋白表达水平，且经Cy处理能逆转这一现象。（见图4～5）

4 讨论

Cy（木犀草素-7-0-葡萄糖苷）是广泛存在于植物中的黄酮类化合物。Cy具有邻二酚羟基的结构，使其能产生独特的药理作用[3]。Cy主要的功效包括抗炎、抗菌、清除自由基、抗氧化和抗肿瘤[10]。此外，研究[3]表明，较高浓度的Cy（25、50、75、100 μmol/mL）会对细胞产生一定的毒副作用，因此本研究采用CCK-8法检测了不同浓度的Cy对SW1353细胞增殖的影响。实验结果表明，Cy在30 μmol/mL时细胞活性有所下降，所以本研究选取10、20 μmol/mL的Cy作为后续实验的处理浓度。

促炎因子的表达在骨关节炎中发挥着重要的作用，其中IL-1β是促炎性细胞因子，可以通过诱导软骨基质降解酶[如基质金属蛋白酶（MMPs）、血小板反应蛋白解整合素金属肽酶（ADAMTSs）]及其他分解代谢因子和前列腺素E2（PGE2）的上调而加速骨关节炎的发展[11-12]。本研究结果表明，经IL-1β诱导处理后，SW1353细胞MMP-13 mRNA、MMP-13蛋白及IL-6 mRNA表达水平显著增高，但是在加入Cy后其表达水平明显下降。结果表明，Cy可以抑制软骨基质降解酶和相关炎症因子的表达。

软骨细胞外基质（ECM）的进行性和过度降解，是OA的主要特征之一[13-15]。其主要由Ⅱ型胶原（COL2a1）和蛋白聚糖（如聚集蛋白聚糖）组成；它们可为软骨提供高度的结构完整性，并吸收压缩力和冲击力[16-17]。本研究结果表明，IL-1β诱导处理后，SW1353 细胞外基质COL2a1 mRNA、ACAN mRNA、COL2a1蛋白、ACAN蛋白表达水平显著下调，但是在加入Cy后其表达量明显上升。结果表明，Cy可以通过抑制软骨细胞外基质的降解，发挥软骨保护作用。

lncRNA是长度超过200个核苷酸的非编码转录物，其异常表达与多种人类疾病有关。在骨关节炎的发展过程中，多种lncRNA参与了软骨细胞外基质的降解和随后的关节软骨损伤[18]。lncRNA在调节OA的基因表达中具有重要作用[19]。研究表明，lncRNA SNHG14可通过靶向抑制miR-136-5p上调ROCK1表达[20-21]，从而促进MCAO/R诱导的神经损伤和炎症反应[5]。lncRNA SNHG14在各种炎症的发生发展中同样有着重要的作用[22-24]。本研究结果表明，经IL-1β诱导处理后，SW1353细胞中lncRNA SNHG14的表达明显上调，但经Cy处理后其lncRNA SNHG14的表达显著下降。表明Cy可以通过抑制lncRNA SNHG14的表达来发挥减轻炎症和软骨保护的作用。

综上所述，Cy能够改善骨关节炎软骨细胞的炎症反应和细胞外基质降解，其作用机制可能是抑制lncRNA SNHG14表达。但本研究仅是体外细胞实验，尚缺乏动物实验的证据进行支持。这将是本研究下一步的研究方向，具体的作用机制也需要进一步的研究才能够阐明。