超声辐照对载盐霉素钠纳米气泡的药物释放作用

徐君君,孙碧云,凌 茜,彭 炜,江 峰

(皖南医学院第一附属医院 弋矶山医院 超声医学科,安徽 芜湖 241001)

前列腺癌是男性泌尿生殖系统最常见的恶性肿瘤之一[1],目前临床常用的主要治疗方法多为手术治疗、放射治疗和化学治疗,这些治疗方案具有较强的全身性副作用。高强度聚焦超声(high intensity focused ultrasound,HIFU)已被用于病理病变的热消融,通过细胞膜上孔的瞬时形成进行局部微创超声介导的药物递送,皮肤和血脑屏障的暂时破坏,超声波诱导血栓分解,以及使用超声波和温度敏感药物载体有针对性地释放药物[2]。盐霉素通过抑制Nrf2信号传导诱导氧化和内质网应激,从而触发前列腺癌PC3细胞凋亡[3]。盐霉素钠是盐霉素的钠盐形式,价格低于盐霉素,盐霉素钠和盐霉素对乳腺癌的杀伤作用未出现明显差异[4]。脂质纳米颗粒是一个多功能的递送平台,克服了基因治疗的主要障碍,即核酸降解和有限的细胞摄取[5]。Qian等研制的靶向于神经肽Y1受体的纳米气泡对乳腺癌具有靶向作用,增强滞留效应[6]。本研究旨在观察超声波辐照能否增加载盐霉素钠纳米气泡中药物的释放,为肿瘤疾病的精准治疗提供思路。

1 材料与方法

1.1 空白脂质体纳米气泡的制备 以一定比例称取二苯基磷酰基叠氮化物、二硬脂酰磷脂酰胆碱、生物素化二硬脂磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇,加入旋转蒸发仪的茄形瓶中,再加入2∶1氯仿/甲醇,混合后旋蒸为均匀薄膜样。用10 mL PBS缓冲液,使薄膜样物质充分溶解于缓冲液中。向溶液瓶充入六氟化硫(SF6)气体,随后用银汞调和器振荡90 s,并通过0.22 μm过滤器,得到的即为空白脂质体纳米气泡,置于4℃冰箱保存。重新称量上述3种试剂,同时向茄形瓶中加入一定量盐霉素钠,余过程与上述实验类似,得到载盐霉素钠纳米气泡,4℃冰箱保存。

1.2 脂质体的表征 采用倒置显微镜和透射电子显微镜(TEM)观察两种脂质体纳米气泡的形态。采用纳米颗粒跟踪分析仪测量纳米气泡粒径大小,检测两种纳米气泡的浓度。

1.3 PC3细胞培养 PC3细胞购自广州赛库生物技术有限公司,培养基为89% F-12K培养基+10%胎牛血清+1%青霉素-链霉素溶液,放置在pH 7.2～7.4、温度37℃、湿度95%、5%CO2的培养箱中培养。

1.4 CCK-8实验 每组5个复孔,细胞悬液量为100 μL/孔,100 μL悬液中约2 000个细胞,接种4块同样的96孔板,将4块培养板放在培养箱中培养。

接种细胞悬液的培养板培养24 h后,向6孔板其中4个孔中分别加入3 mL细菌过滤器过滤后的载药纳米气泡,4个孔分别对应1.0、1.5、2.0、2.5 W/cm24个超声辐照强度。调整超声治疗仪强度为1.0 W/cm2,将6孔板底部均匀涂上超声耦合剂,超声治疗仪探头紧贴6孔板底部,分别照射0、5、10、15、20、25 s。分别取照射0、5、10、15、20、25 s后的载药纳泡加入96孔板对应的分组,每孔加入100 μL纳米气泡。调整超声治疗仪辐照强度为1.5、2.0、2.5 W/cm2,用同样的方法将载药纳米气泡加入另外3块96孔板,将辐照后的4块96孔板放入细胞培养箱中继续培养。

细胞培养24 h后,向每孔中加入10 μL CCK-8试剂,避光操作。加入CCK-8试剂2 h后,设置酶标检测仪波长为450 nm,测量此波长下细胞的吸光度(OD)值。根据OD值,得到不同辐照强度和时间细胞的活力改变,每组OD值去除最大和最小值进行数据分析。

2 结果

2.1 PC3细胞生长状态良好 前列腺癌PC3细胞为梭形、贴壁生长细胞,光学显微镜下可观察PC3细胞形态为梭形,生长情况良好,细胞均质而透明,折光性良好,培养基清亮透明,镜下可见细胞背景干净清晰,提示PC3细胞生长状态佳(图1)。

图1 光学显微镜下观察PC3细胞的生长情况(×100)

2.2 显微镜下观察两种纳米气泡 光学显微镜下观察,可见两种纳米气泡呈圆形,大小一致,形态良好(图2A、B)。透射电子显微镜下空白纳米气泡(图2C)呈圆形,大小均一;载药纳米气泡内可见分散均匀的黑色颗粒状物质,考虑为携带的盐霉素钠颗粒(图2D)。

A.显微镜下观察空白纳米气泡(×400);B.显微镜下观察载药纳米气泡(×400);C.透射电镜下观察空白纳米气泡(200 nm);D.透射电镜下观察载药纳米气泡(200 nm)。

2.3 两种纳米气泡粒径大小和浓度的测定 结果显示,两种纳米气泡第0天～第14天测得的粒径大小差异均无统计学意义(P>0.05),见表1。

表1 两种纳米气泡随时间改变气泡粒径大小变化情况 nm

2.4 光学显微镜下观察不同超声辐照强度照射后释放的盐霉素钠对前列腺癌PC3细胞的改变 光学显微镜下观察,同一辐照时间,随着辐照强度的增加,可见细胞形态发生改变。相比于辐照过的载药纳米气泡,未辐照过的载药纳泡对细胞活力的影响较小(图3)。

A.对照组(×200);B.1.0 W/cm2辐照5 s组(×200);C.1.5 W/cm2辐照5 s组(×200);D.2.0 W/cm2辐照5 s组(×200);E.2.5 W/cm2辐照5 s组(×200)。

2.5 超声辐照后细胞活力变化 同一辐照强度下,与0 s相比,OD值均下降(P<0.05);辐照强度1.5 W/cm2时,10 s与5 s相比,OD值下降(P<0.05);辐照强度2.0 W/cm2时,15 s与10 s相比,OD值下降(P<0.05)。同一辐照时间(5～25 s),与2.5 W/cm2相比,OD值均升高(P<0.05)。辐照时间为10、20、25 s时,1.5 W/cm2与1.0 W/cm2相比,OD值均下降(P<0.05);辐照时间为25 s时,2.0 W/cm2与1.5 W/cm2相比,OD值下降(P<0.05)。见表2。

表2 不同时间和不同强度超声辐照下释放的盐霉素钠对细胞的杀伤作用(OD值)

3 讨论

近年来纳米技术快速发展,有研究证实制备靶向于目标疾病的纳米气泡,在目标部位予以超声辐照可以触发惰性气体产生微气泡,引起超声空化效应;与此同时合适的超声辐照强度和辐照时间还能促进包裹药物的纳米气泡定向释放携带的药物,达到定向治疗的作用[7-8]。

盐霉素为脂溶性物质,不溶于水,限制了其在研究和临床中的应用。盐霉素钠是盐霉素的钠盐形式,具有相似的化学结构和性质,但市场价格盐霉素钠明显低于盐霉素,有研究证实,对于人乳腺癌细胞系MCF-7,盐霉素钠和盐霉素具有相似的抑制作用[4]。本研究将盐霉素钠载入脂质体纳米气泡中,有利于脂溶性药物对细胞产生作用,开拓了脂溶性药物在研究中的应用。有研究团队研发了盐霉素纳米晶体,与游离盐霉素相比,盐霉素纳米晶体提高了细胞摄取效率[9]。有研究检测了前列腺癌细胞株PC-3和非恶性前列腺细胞株RWPE-1的细胞活力,盐霉素处理后,两种细胞系的细胞活力呈剂量和时间依赖性下降[10-13]。本研究发现经辐照后释放的盐霉素钠对前列腺癌PC3细胞具有杀伤作用,辐照强度和辐照时间不同,释放出的盐霉素钠含量不同。随着研究方法和方式的进步以及社会的需要,盐霉素的潜在功能还有待发掘。

超声波体外控制药物的释放,可以提高药物的利用率,减少药物的毒副作用[14]。近年有研究通过编程构建低强度超声聚焦超声触发相变递送阿霉素纳米系统,以显著增强抗癌药物递送[15]。本研究成功制备空白纳米气泡和载盐霉素钠纳米气泡,两种纳米气泡粒径大小随时间改变差异无统计学意义,纳米气泡状态较稳定。本研究发现纳米气泡释放的盐霉素钠量与超声辐照干预的时间及辐照强度相关,随着辐照时间与强度的改变,释放的盐霉素钠量发生改变。同一辐照时间下,辐照强度2.5 W/cm2时,释放的盐霉素钠的量较辐照强度1.0 W/cm2、1.5 W/cm2、2.0 W/cm2更多;同一辐照强度,辐照时间为5 s时释放的盐霉素钠量与未辐照组差异有统计学意义。辐照强度和时间的增加会对正常组织产生损伤作用[16],我们在实验过程中应该选用合适的辐照时间和辐照强度,在有效治疗肿瘤的同时,减少对正常细胞组织的杀伤作用。结果表明超声辐照可以帮助载盐霉素钠纳米气泡中盐霉素钠的释放,为前列腺癌的精准治疗提供了思路和方法。

本研究发现在超声辐照下载盐霉素钠纳米气泡释放出盐霉素钠,释放出的盐霉素钠对前列腺癌PC3细胞产生杀伤作用。同时,本研究也存在不足之处,探究释放的负载药物对癌细胞的杀伤作用时,应检测单纯超声辐照对癌细胞的作用,确定超声对正常组织和细胞作用较小的辐照强度和时间。合适的辐照时间和强度在对药物进行释放的同时,也能减少辐照对周围正常组织和细胞的损伤,因此合适的超声辐照强度和时间对癌细胞以及正常组织细胞的作用还需要进一步研究。有研究证实,STEAP-1抗体可以靶向于前列腺癌PC3细胞[17],纳米气泡携带特异性抗体,并依靠抗原-抗体之间的特异性结合方式,将特异性抗体连接到纳泡表面,通过血液循环特异地积聚到靶器官或靶组织,应用实体瘤的高通透性和滞留效应,达到靶向给药的作用。能否制备出靶向载药纳米气泡,并探究靶向和超声辐照共同作用下提高目标部位的药物浓度,减少对其他组织器官的药物副作用,也需要进一步研究。纳米颗粒在药物递送和靶向治疗方面的研究,以及超声辐照在纳米气泡液-气相转变方面的作用,不仅给癌症患者带来治疗希望,也对其他疾病的治疗提供了方法和思路。