TLR4/MyD88在单一延长应激诱导的PTSD大鼠海马中的表达及意义

赵亚楠， 黄德盛， 陈 云， 孙艺瑶， 覃伟林， 谢菊华

创伤后应激障碍（post-traumatic stress disorder，PTSD）是目睹或经历创伤事件后出现的精神或心理疾病，主要表现为个体主动回避、警觉性增加、反复体验创伤事件等［1］。据最新流行病学调查［2］发现，187例严重创伤患者中诊断为PTSD的可达28.34%，参与新冠疫情救治的3 762名护理人员中PTSD筛查阳性率高达53.8%［3］。PTSD 持续存在将可能导致患者工作效率降低、社交退缩、酗酒暴力，严重者甚至出现自残自杀等行为，因而及时诊断及干预PTSD显得尤为重要。但目前PTSD 的发病机制尚不清楚，如何有效预防和干预尚待进一步深入研究。Toll 样受体4（Toll-like receptors，TLR4）是一类跨膜模式识别受体，可通过髓样分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）将细胞表面信号传递到细胞核，激活NF-κB，进而诱导多种炎症因子、趋化因子等表达，促进炎症反应、破坏免疫稳态［4，5］。研究发现TLR4/MyD88 信号参与了许多疾病如痴呆、脑出血、慢性酒精中毒、抑郁等的发生发展，在神经炎症、学习记忆、抑郁行为等调节上发挥了重要作用［5-7］。本研究拟采用国际公认的单一延长应激（singleprolonged stress，SPS）诱导PTSD，观察Toll 样受体4信号在单一延长应激诱导PTSD 中的表达变化，为PTSD 动物模型研究及其发病机制研究提供实验数据与依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组 成年雄性Wistar大鼠购自辽宁省长生生物有限公司，45只，体重160～200 g。将大鼠随机分为健康对照组15只、PTSD 组30只（造模后4 d组、造模后7 d 组各15 只）。适应性喂养5～7 d 后，PTSD 组采用既往研究中单一延长应激建立动物模型，具体程序如下［5，6］：（1）禁锢大鼠2 h；（2）强迫游泳20 min；（3）休息15 min 后乙醚麻醉1～3 min致深度昏迷。随后常规喂养至取材。

1.2 Morris 水迷宫 Morris 水迷宫检测大鼠空间学习记忆能力。水迷宫设备由一个圆形恒温水槽和一个带视频计算机跟踪系统的摄像头组成。水槽直径1 m，水温恒定，深度50 cm，分为4个象限。SPS刺激后连续5 d训练大鼠寻找平台2次，6 d移除平台后，记录大鼠到达平台的踪迹及所需时间（潜伏期）。比较健康对照组及PTSD模型组的平均潜伏期。

1.3 尼氏染色 SPS 刺激4 d、7 d 分别腹腔麻醉大鼠，麻醉成功后暴露出大鼠心脏，剪开大鼠右心耳后立即用生理盐水灌流；随后用4%组织固定液灌流，待大鼠肝脏发硬终止灌流。断头取大鼠脑组织并浸泡在固定液中，6 h后石蜡包埋、切片。常规脱蜡水化后，用1%的甲苯胺蓝55 ℃温箱孵育30 min，随后蒸馏水冲洗5 min后伊红染色10 s，继续蒸馏水冲洗后梯度酒精分化、二甲苯透明、封片。最后光学显微镜下观察健康对照组与PTSD组海马神经元形态。

1.4 Western blotting 检测 分别于SPS刺激4 d、7 d麻醉大鼠并断头取脑、剥离海马组织。根据海马重量加入裂解液，超声粉碎后离心后取上清。应用BCA 蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度。测完浓度的蛋白置入99 ℃金属浴中变性5 min。各组分别取同重量蛋白上样，采用8%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶上电泳，待蛋白跑至电泳槽底部时转为200 mA转印槽转膜1 h。随后5%BSA 常温封闭1.5 h，稍微清洗膜后加入相应一抗4 ℃过夜（TLR4：Samta 公司，1∶500 稀释；MyD88：Abclone 公司，1∶500 稀释；NF-κB： Abclone公司，1∶500稀疏；GAPDH：北京中杉金桥公司，1∶1 000稀释）。TBST 充分洗膜后加入二抗孵育1.5 h。二抗孵育结束后TBST充分洗膜并ECL发光显影。

1.5 统计学分析 将所得分析数据结果用（±s）表示，对获得的条带经Image J软件分析，对各组灰度值TLR4/GAPDH、MyD88/GAPDH、NF-κB/GAPDH的比值进行数据分析。组间差异应用单因素方差分析，组间两两比较采用独立样本间t检验，并以P＜0.05表示组间差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 Morris 水迷宫检测结果 Morris 水迷宫是最常见的用于检测啮齿类动物空间记忆的常见方法。SPS 刺激后6 d 移除平台后，健康对照组（Normal）与PTSD 组（SPS）典型的运动曲线及平均潜伏期见图1，结果表明PTSD 组运动曲线相对杂乱、平均潜伏期明显延长（P＜0.05），提示单一延长应激后大鼠空间记忆能力降低。

图1 Morris水迷宫检测结果

2.2 尼氏染色结果 为观察单一延长应激对大鼠神经元形态的影响，我们采用尼氏染色观察了两组大鼠神经元的形态改变，观察发现：健康对照组神经元排列规整，胞浆中充满尼氏体。而单一延长应激刺激后，大鼠神经元尼氏体数量减少、胞浆染色明显变淡（见图2）。

图2 两组大鼠海马神经元尼氏染色结果

2.3 TLR4/MyD88表达变化 单一延长应激后4 d、7 d 取材大鼠海马组织检测TLR4/MyD88 蛋白表达改变见图3。PTSD 组TLR4 蛋白表达逐渐增加，SPS 刺激后7 d 组TLR4 水平较对照组有统计学差异（P＜0.05）。MyD88 的表达变化与TLR4一致，SPS刺激后7 d有显著升高（P＜0.05）。这些结果提示PTSD大鼠海马组织TLR4/MyD88 信号激活，这可能与其空间记忆受损有关。

图3 Western blotting法检测各组TLR4/MyD88蛋白表达

2.4 TLR4 下游指标NF-κB 的表达改变 为进一步了解TLR4/MyD88 信号通路的激活情况，我们进一步观察了各组TLR4 下游指标NF-κB的表达改变，结果如图4 所示。单一延长应激后4 d、7 d NF-κB 蛋白表达均明显增加，较健康对照组均有统计学差异（P＜0. 05），进一步提示PTSD大鼠海马组织TLR4/MyD88/NF-κB 信号通路激活。

图4 Western blotting法检测各组NF-κB蛋白表达

3 讨 论

PTSD 多见于严重创伤事件后，据报道超70%的成人在一生中会经历创伤事件。在经历创伤事件的人群中，约20%～30%可进一步发展为PTSD，饱受噩梦、持续回避等困扰［8］，但目前临床上尚缺乏治疗或干预PTSD 发展的有效措施，目前也只有少量抗焦虑、抗抑郁药物被用于PTSD 的临床治疗。探讨PTSD 的具体发病机制及有效干预靶点对PTSD 的临床救治及干预至关重要。

目前大脑神经炎症被认为是PTSD 病程发生发展的重要机制之一［9-11］。多因素作用下，免疫细胞激活、大量炎症因子尤其是促炎因子的释放可参与大脑皮质、海马等关键脑区突触可塑性、神经元存活等，进而影响学习记忆及导致抑郁焦虑情绪障碍［12］。据研究报道，单一延长应激可使促炎细胞因子表达增加、学习记忆能力下降，且在精神疾病的发生发展中有直接作用［13，14］。在小鼠外周注射脂多糖也可引起杏仁核、海马、皮质等关键恐惧回路脑区炎症反应增加，因而从神经炎症探讨PTSD发病机制可能为干预PTSD发生发展提供可能治疗靶点。

TLR4/MyD88/NF-κB 是最常见的促进炎症反应的信号通路。TLR4在神经系统中可分布于神经元、小胶质细胞及神经干细胞等［15］。脂多糖、病毒RNA、热休克蛋白等病原或损伤相关分子模式被TLR4胞外部分识别后，可激活MyD88依赖途径触发核内信号，激活NF-κB 等，从而启动炎症因子、趋化因子、黏附因子等多种细胞因子的转录与表达。目前已有大量文献表明TLR4/MyD88/NF-κB 参与了许多神经疾病的发生发展。例如，缺血性脑卒中病灶内炎症细胞聚集、小胶质细胞激活，TLR4/MyD88/NF-κB 信号通路激活，而抑制该通路，可减轻缺血性脑卒中所致脑损伤［16］。阿尔茨海默病模型小鼠TLR4/NF-κB 信号激活，给予TLR4 抑制剂可使小鼠小胶质细胞氧化应激、炎症反应均明显减轻［17］。

在本研究中，Morris 水迷宫结果显示单一延长应激暴露后大鼠平均潜伏期延长，提示单一延长暴露可致小鼠空间记忆功能受损，直接验证PTSD 造模成功。同时尼氏染色观察发现大鼠海马神经元尼氏体数量减少、胞浆染色明显变淡，表明PTSD 模型大鼠海马神经元受损。此外，单一延长应激刺激4 d、7 d 大鼠海马TLR4、MyD88 表达均逐渐增多，同时其下游NF-κB 也均有同样趋势变化，表明单一延长应激可致大鼠海马TLR4/MyD88/NF-κB 信号通路激活。单一延长应激致大鼠海马神经元损伤及空间记忆功能受损可能与其海马TLR4/MyD88/NF-κB上调有关。TLR4/MyD88 信号通路激活可能是单一延长应激模拟PTSD 过程中海马损伤的重要分子机制之一。

伦理学声明：本研究方案经由沈阳医学院伦理委员会审批（批号：SYYXY2021060102），项目实施过程中根据《实验动物管理条例》等相关法律规定和规章要求，尽可能用最少量动物、尽量减少动物痛苦。

利益冲突声明：所有作者均声明不存在利益冲突。

作者贡献声明：赵亚楠负责起草论文；黄德盛、陈云负责实验操作、研究过程的实施；孙艺瑶、覃伟林负责数据收集、统计学分析、绘制图表；赵亚楠、黄德盛负责论文修改；谢菊华负责拟定写作思路、指导撰写文章并最后定稿。