miR-125b-5p对骨质疏松症大鼠骨丢失的影响及其分子机制*

王槐骏,杨城,李玮民,冉栋成,彭维艳,王春庆

(1.贵州医科大学 临床医学院,贵州 贵阳 550004; 2.贵州医科大学附属医院 急诊外科,贵州 贵阳 550004)

骨质疏松症(osteoporosis,OP)是一种临床表现为骨强度下降的代谢性骨骼疾病,其特征是骨量减少和骨组织微观结构破坏[1]。目前治疗OP的药物主要包括双磷酸类药物、骨合成代谢药物、雷洛昔芬及雌激素等,但并不能治愈OP[2]。因此寻找新的治疗方法或者靶点对于抑制OP的发生发展具有重要的意义。微小RNA(microRNA,miRNA或miR)是一类长度约为20～25个核苷酸的非编码单链RNA,是重要的转录后调控因子,常异常表达在许多疾病发生的过程中[3]。miRNA通过结合靶基因的3′-非翻译区(untranslated region,3′-UTR)来干扰mRNA表达,从而改变生物活性[4]。miRNA通过相关信号通路调节靶基因的表达最终影响骨的生成及代谢[5]。因此有理由认为miRNA在OP的发病进程中起着重要的作用。目前已有研究报道,miR-125b-5p在脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的骨丢失小鼠模型中显著升高[6];此外,OP患者外周血和骨组织中miR-125b表达均异常升高[7],且miR-125b能够抑制人牙周膜干细胞的成骨分化[8],因此有理由认为miR-125b-5p可能参与了OP的发病进程。然而,miR-125b-5p对OP大鼠骨丢失的调控作用及相关分子机制目前尚不十分清楚。因此,本研究拟探讨miR-125b-5p对OP大鼠骨丢失的影响,同时利用生物信息学方法探讨其潜在的分子机制,为阐明OP的分子机制提供实验基础及理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1实验动物 6月龄健康清洁级Sprague-Dawley (SD)雌性大鼠15只,体质量(300±100)g,购自于学校动物房(430726210100391485);本研究已获得学校实验动物伦理审查委员会批准(1702032)。

1.1.2主要试剂与仪器 miR-125b-5p激动剂 (miR-125b-5p agomir,agomiR-125b-5p)、空载体阴性对照(NC agomir,agomiR-NC;上海吉玛基因公司),磷酸盐缓冲液(phosphate buffered solution,PBS)缓冲液及1 mL注射器(中国biosharp公司);显微计算机断层扫描(microscopic computed tomography,micro-CT;德国Siemens 公司)。

1.2 研究方法

1.2.1基因芯片信息 从公共基因表达数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov)[9]获取OP相关数据集(GSE93883),其中包括3例健康人群的血浆样本(GSM2464442、GSM2464443及GSM2464445),3例OP患者的血浆样本(GSM2464453、GSM2464446及GSM2464451)。使用GEO2R工具在线分析筛选差异基因,将基因芯片表达矩阵信息下载分析miR-125b-5p的表达量,利用R软件进行火山图及热图可视化,标注miR-125b-5p;参数默认;差异阈值为fold change>2和P<0.05。

1.2.2OP模型大鼠的构建 选取3只大鼠,予5%异戊巴比妥钠按5 mg/100 g行腹腔注射麻醉,脊柱两侧背部肋骨下缘开1～2 cm切口,剪下卵巢及部分输卵管,予青霉素20 000 U/只腹腔注射预防感染3 d,为OP组;另选取大鼠3只,只行背部切口,不切除卵巢,为假手术(sham operation,Sham)组。术后3月,对上述2组大鼠采用micro-CT以12～20 μm的分辨率扫描骨骼,使用Bruker mCT评估软件构建和分析骨骼的3D图像,以骨体积分数(percent bone volume,BV/TV)、骨密度bone mineral density,BMD)评价OP模型构建是否成功[10]。

1.2.3OP大鼠分组及给药 选择6月龄雌性SD大鼠9只,按“1.2.2”项下方法构建OP模型大鼠,随机均分为agomiR-NC组(agomiR-NC干粉33 μg+PBS溶液125 μL)、PBS组(PBS溶液125 μL)及agomiR-125b-5b组(agomiR-125b-5p干粉33 μg+PBS溶液125 μL),各组大鼠尾静脉注射相应处理,1次/周,持续2个月;干预结束后脱颈椎处死各组大鼠,收集胫骨进行micro-CT扫描,记录BV/TV、BMD、骨小梁数目(trabecular number,Tb.N)、骨小梁分离度 (trabecular separation,Tb.Sp)及结构模式指数(structure model index,SMI)等骨相关参数。

1.2.4hsa-miR-125b-5p-mRNA靶基因预测 公共数据库 starbase(https://starbase.sysu.edu.cn/)作为微小rna-125b-5p (hsa-miR-125b-5p)靶基因预测来源,选择以5种预测软件中至少在4种预测软件(targetScanSites[11]、picTarSites、RNA22Sites、PITASites、miRandaSites[12])中都预测到的信使RNA(messenger RNA,mRNA)作为最终结果,再使用cytoscape软件[13]对miR-125b-5p-靶基因调控网络进行可视化。

1.2.5基因本体( gene ontology,GO)功能富集分析、京都基因和基因基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)信号通路分析 使用clusterProfiler R包(v3.18.1)[14]对在“1.2.4”项下至少4种预测软件都预测到的靶基因进行GO富集和KEGG分析。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 miR-125b-5p的表达

通过GEO2R在线分析共获得956个差异miRNA,其中502个上调,454个下调;利用 R 包绘制火山图及热图进行可视化分析发现,OP患者血浆中miR-125b-5p显著增高。见图1。

注：A为通过GEO2R在线分析筛选出的差异基因绘制的火山图,红点表示上调的miRNAs,绿点表示下调的miRNAs,灰点表示无显著意义变化的miRNAs;B为利用基因芯片表达矩阵信息绘制的热图,红色表示差异miRNAs上调,蓝色代表差异miRNAs下调。

2.2 OP模型大鼠的构建

去卵巢术后3个月对OP组及Sham组大鼠胫骨行micro-CT扫描提示,相较于Sham组,OP组大鼠胫骨骨量明显减少,且BV/TV、BMD低于Sham组(P<0.05或P<0.01),提示本研究OP模型构建成功。见图2。

注：A为micro-CT扫描松质骨三维成像图(2.3×),B、C分别为BV/TV和BMD的定量结果;与Sham组比较,(1)P<0.01,(2)P<0.05。

2.3 agomiR-125b-5p对OP大鼠骨量的影响

去卵巢术后连续注射2月对3组大鼠胫骨行micro-CT扫描,结果提示(图3),与agomiR-NC组与PBS组比较,agomiR-125b-5p组大鼠骨小梁稀疏,骨量减少;与agomiR-NC组比较,agomiR-125b-5p组大鼠胫骨BV/TV和Tb.N下降,Tb.Sp和SMI升高,差异均有统计学意义(P<0.05);agomiR-NC组与PBS组大鼠胫骨上述指标比较,差异无统计学意义(P>0.05)。

注：A为micro-CT扫描二维成像图(2.3×);B为BV/TV、Tb.N、Tb.Sp及SMI骨参数指标定量结果;(1)与agomiR-NC组比较,P<0.05。

2.4 hsa-miR-125b-5p的靶基因

预测结果显示,4 种软件预测hsa-miR-125b-5p的靶基因102个,进行网络进行可视化(图4);5 种软件都预测到hsa-miR-125b-5p 的靶基因8个,分别是BCL2拮抗剂/杀伤因子1(BCL2 antagonist/killer 1,BAK1)、磷酸核糖焦磷酸酰胺转移酶(phosphoribosyl pyrophosphate amidotransferase,PPAT)、亮氨酰和胱氨酰氨肽酶(leucyl and cystinyl aminopeptidase,LNPEP)、SUV39H1组蛋白赖氨酸甲基转移酶(SUV39H1 histone lysine methyltransferase,SUV39H1)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖4 (glypican 4,GPC4)、丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶11 (mitogen-activated protein kinase kinase kinase 11,MAP3K11)、高尔基体相关ARF结合蛋白2 (golgi associated,gamma adaptin ear containing,ARF binding protein 2,GGA2)及氧甾醇结合蛋白样9 (oxysterol binding protein like 9,OSBPL9)。

注：红色为hsa-miR-125b-5p,蓝色则为hsa-miR-125b-5p下游预测到的mRNA。

2.5 GO功能富集分析和KEGG信号通路分析

对“2.4”项下预测到的102个靶基因进行GO富集分析,根据富集数目及显著程度,选取10条GO功能过程绘制气泡图,结果显示,GO富集涉及生物过程(biological process,BP)主要包括pre-microrna的处理、负调控冷诱导产热和调节细胞生长的程度等,分子功能(molecular function,MF)显示主要为金属胺肽酶活性、泛素结合酶活性等;对预测到的102个靶基因进行KEGG分析,选取前10条通路,结果显示KEGG信号通路为肾素-血管紧张素系统和泛素介导的蛋白质水解等。见图5及表1。

表1 预测的miR-125b-5p下游靶基因的KEGG信号通路

注：A、B及C分别为BP、MF及KEGG信号通路;颜色越红代表P值越小、可信度越高,圆点越大、表示数目越多。

3 讨论

前期研究发现OP患者miR-125b-5p异常升高[15],因此有理由认为miR-125b-5p可能参与OP的发生发展。为了研究miR-125b-5p在OP进程中的作用,首先利用生物信息学技术分析表明,miR-125b-5p在OP患者血浆中显著升高,这个结果进一步表明了miR-125b-5p在OP中的重要性。因此,为研究miR-125b-5p在OP中的作用,本课题组将miR-125b-5p的模拟物注射到双侧卵巢切除后的大鼠尾静脉,用以评估其作用。双侧卵巢切除术的雌性大鼠目前已经成为最常用的OP模型,可模拟绝经后由于雌激素缺乏所诱导的骨丢失[16]。通过大鼠尾静脉注射后收集各组大鼠胫骨进行micro CT扫描检测的结果表明,相较于其他组,agomiR-125b-5p 组大鼠胫骨BV/TV和Tb.N下降,Tb.Sp和SMI升高。BV/TV、Tb.N、Tb.Sp及SMI均是骨结构参数,可用于精准检测松质骨的定量分析[17]。上述结果表明了agomiR-125b-5p可以显著促进去卵巢后大鼠由于雌激素缺乏所诱导的骨丢失。

上述结果表明agomiR-125b-5p可以促进OP大鼠的骨丢失,但是其调控骨丢失下游的靶基因及通路尚未明确,因此本研究通过生物信息学对其进行分析。首先对miR-125b-5p进行靶基因预测,由于不同预测软件预测有一定差异,因此取5种预测软件所获得的靶基因交集进行探讨更具有可信度;分析后取交集共获得了靶基因8个,分别是PPAT、LNPEP、SUV39H1、GPC4、BAK1、MAP3K11、GGA2及OSBPL9,提示这些预测到的靶基因可能与miR-125b-5p促进骨丢失密切相关。有研究报道,缺乏 BAK会减少成骨细胞和骨细胞的凋亡并增加骨量[18]。miR-125b-5p可能是通过减少BAK1的表达,进而减少成骨细胞的凋亡,最终增加骨量,因此BAK1可能是参与OP的发病的重要靶基因。而其他预测到的靶基因关于OP的研究尚不清楚,因此这些靶基因可作为调控OP发展下游的分子进行研究,为阐明OP的分子机制研究提供实验依据。

GO与KEGG富集分析有助于更深入地认识并识别出miR-125b-5p靶基因的功能和机制。对4种软件预测到的102个靶基因进行GO富集和KEGG分析,结果显示miR-125b-5p靶向基因的BP主要在pre-microrna的处理、负调控冷诱导产热及调节细胞生长的程度等;pre-microRNAs(pre-miRNAs)是60～120个核苷酸(nt)的茎环结构,能够被核糖核酸酶(ribonuclease,RNase)Ⅲ酶Dicer切割成短的约21 nt的双链(ds)RNAs,该双链RNAs可与microRNA效应子Argonaute(Ago)结合,结合后去除1条RNA链,再由Ago-miRNA复合体通过翻译抑制和mRNA降解抑制目标基因的翻译[19]。在冷诱导的棕色脂肪组织(brown adipose tissue,BAT)非战栗产热(non-shivering thermogenesis,NST)会激活相关的代谢效应,包括增加能量消耗、胰岛素敏感性、脂肪分解和脂肪酸氧化,最终有助于控制肥胖和代谢性疾病存在的能量失衡和病理生理后果[20]。以上结果揭示,miR-125b-5p的靶基因可能主要是通过Ago-miRNA复合体抑制目标基因的翻译、调节冷诱导产热的相关代谢效应以及相关成骨细胞与破骨细胞的生长最终促进OP大鼠的骨量丢失。

在GO富集MF中,金属氨基肽酶活性位居前列,该酶存在于所有类型的生物体中,可利用外源性蛋白质作为营养物质和消除非功能性蛋白质,在胚胎发生、免疫反应、血管生成、肿瘤细胞侵袭和转移等生理及病理过程中发挥关键作用[21]。泛素结合酶系统与几种退行性疾病有关,在C-X-C基序趋化因子配体6(C-X-C motif chemokine ligand 6,CXCL7)缺陷小鼠中进行了磷酸化蛋白质组学分析,结果显示泛素蛋白连接酶 E3C (ubiquitin protein ligase E3C,UBE3C)磷酸化增加,CXCL7与后纵韧带骨化密切相关[22]。这些表明miR-125b-5p的靶基因促进OP大鼠骨丢失在分子功能上可能是通过调控金属氨基肽酶活性及泛素结合酶等来进行的。

KEGG富集分析结果显示,肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin system,RAS)在miR-125b-5p靶基因的KEGG分析中占主要作用。有研究表明,RAS在骨组织中局部存在,并且在成骨细胞和破骨细胞上表达,还可通过血管紧张素Ⅱ (angiotensinⅡ)受体发挥作用,对炎症性骨病起到重要作用[23]。有研究表明,RAS 的激活诱导高周转OP并加速骨吸收[24]。Li等[25]研究发现,泛素特异性蛋白酶(ubiquitin-specific protease,USPs)通过促进骨形成或拮抗骨吸收参与调节骨代谢,泛素特异性肽酶26(ubiquitin specific peptidase 26,USP26)通过降低293T细胞中泛素化进而对骨代谢进行调控。Yang等[26]发现泛素化和降解在保持破骨细胞的活性及骨吸收方面起着重要作用。以上结果表明,肾素-血管紧张素系统信号转导通路和泛素介导的蛋白质水解信号转导通路在调控骨代谢中起着重要作用,提示这些相关通路与miR-125b-5p调控OP大鼠骨量丢失的潜在机制密切相关,可作为后续的研究提供思路。

综上所述,miR-125b-5p能够促进OP大鼠的骨丢失,其潜在的机制可能是通过BAK1等相关mRNA相互作用,涉及肾素-血管紧张素系统信号转导通路和泛素介导的蛋白质水解信号转导通路等多种途径从而为下一步研究OP的分子机制提供了实验基础及理论依据。