新型抗菌肽Mt-22S3对白念珠菌细胞壁及细胞膜的作用*

李彩多,曾晔,石艳萍,张迎春,吴建伟,陈峥宏,王涛*

(1.贵州医科大学 基础医学院,贵州 贵阳 550025; 2.贵州省普通高等学校病原生物学特色重点实验室,贵州 贵阳 550025)

抗菌肽(antimicrobial peptides,AMPs)又称为抗微生物肽,是一种具有固有免疫功能的小分子多肽,一般含有12～100个氨基酸残基,在原核生物和真核生物中广泛存在,是生物固有免疫系统的重要组成成分,也是人体抵御病原生物感染的重要防线[1-5]。国内外研究报道,AMPs不仅能够高效地抑制真菌、细菌及病毒等病原微生物,还有抗寄生虫、抗肿瘤和免疫调节的功能,由于AMPs对病原微生物的作用范围广、来源丰富及不易使微生物产生耐药性等特点,因此具有新型抗菌药物的开发潜力[1-6]。研究表明,AMPs有可能通过抑制真菌细胞壁的合成或破坏其完整性,从而导致真菌细胞的死亡[7-9]。有研究显示,细胞膜是AMPs天然作用靶标,AMPs可通过使真菌细胞膜稳定性降低和破坏膜结构的方式,引起细胞内容物外溢,导致真菌细胞死亡[10]。目前可以通过桶板模型、毯式模型及环孔模型来解释AMPs的膜作用机制[11-15]。家蝇抗真菌肽-1A(Muscadomesticaantifungal peptide-1A,MAF-1A)是本课题组发现的家蝇幼虫特有AMPs,前期研究已表明MAF-1A可通过破坏细胞壁、细胞膜发挥抗白念珠菌(Candidaalbicans,C.albicans)作用[16];MAF-1A突变体-22S3(mutant-22S3 of MAF-1A,Mt-22S3)是本课题组通过对MAF-1A 进行序列优化、改造,获得一个新型AMPs分子,前期研究显示Mt-22S3对C.albicans具有较强的抑杀活性[17],但抗C.albicans作用与细胞壁、细胞膜破坏的相关性尚不清楚。本研究旨在探究新型AMPsMt-22S3对C.albicans细胞壁及细胞膜的作用机制,为AMPs的研究与应用提供理论基础及实验数据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1AMPsMt-22S3 委托生工生物工程(上海)股份有限公司采用9-芴甲氧羰基(9-fluorenylmethyloxycarbonyl,FMOC)固相法制备多肽(批次为P27963),并经过反相高效液相色谱纯化谱、液相色谱-质谱技术进行测试,多肽纯度为98%以上。

1.1.2实验菌株C.albicansATCC10231由贵州省普通高等学校病原生物学特色重点实验室提供。

1.1.3主要试剂及仪器 沙氏葡萄糖琼脂培养基(sabouraud dextrose agar,SDA),沙氏葡萄糖肉汤培养基(sabouraud dextrose broth,SDB;杭州百思),碘化丙啶(propidium iodide,PI;北京Solarbio)、2.5% 戊二醛(北京Solarbio),RNA提取试剂(大连TaKaRa),逆转录试剂盒(北京康为世纪)、荧光定量试剂盒(南京诺唯赞);扫描电镜(美国FEI),透射电镜(日本JEOL),正置荧光显微镜(日本尼康ci-e-ds-r11),超微量紫外分光光度计(美国ND2000),实时荧光定量PCR仪(美国STEPONELIUS)。

1.2 研究方法

1.2.1菌株培养及菌悬液配制 采用分区划线法将-80 ℃冻存的C.albicans接种于SDA平板中,于37 ℃的温箱中培养;无菌操作下挑取SDA培养基上对数生长期的C.albicans菌落置于SDB中,以细胞计数法配制菌悬液。

1.2.2Mt-22S3抗C.albicans活性检测 参照美国临床和实验室标准协会(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)推荐的M27-A4方法[18],以终浓度为(31.3～500.0) mg/L的Mt-22S3和MAF-1A分别作用于C.albicans,放置于37 ℃温箱培养24 h。采用微量肉汤稀释法和平板计数法检测Mt-22S3和MAF-1A对C.albicans最低抑菌浓度(minimal inhibit concentration,MIC)和最低杀菌浓度(minimal fungicidal concentration,MFC)。以肉眼观察无菌生长的孔所对应的浓度为最低抑菌浓度;将 MIC试验中判定无菌生长的培养液接种在 SDA平板上,在37 ℃下培养24 h,将无菌生长所对应的最低药物浓度作为最低杀菌浓度。

1.2.3扫描电镜观察Mt-22S3作用后C.albicans形态观察 取对数生长期的C.albicans菌悬液,与终浓度为0、125、250 及 500 mg/L Mt-22S3作用,置于37 ℃温箱培养12 h,4 000 r/min离心5 min,获取C.albicans菌体,经无菌磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline,PBS;pH=7.4)洗涤3次,弃上清液,保留菌体沉淀物;沉淀物中添加2.5% 戊二醛1 mL,置于4 ℃环境中固定过夜;PBS缓冲液(pH=7.4)冲洗2次,弃上清,50%、70% 及100%乙醇依次脱水5 min;载玻片上涂覆沉淀,干燥,使用离子溅射仪喷金处理,并使用扫描电镜上机检测C.albicans形态变化。

1.2.4透射电镜观察Mt-22S3作用后C.albicans形态观察 取对数生长期的C.albicans菌悬液,与终浓度为0、125、250 及 500 mg/L Mt-22S3作用,置于37 ℃温箱培养12 h,4 000 r/min离心5 min,获取C.albicans菌体,PBS缓冲液(pH= 7.4)洗涤3次,弃上清,保留菌体沉淀物;样品经3%戊二醛预固定,1%四氧化锇再固定,丙酮按30%、50%、70%、90%、100%的梯度逐级脱水,采用环氧树脂-812(epikote 812,Ep812)包埋,使用钻石刀制作超薄切片,以醋酸铀、枸橼酸铅进行染色,使用透射电镜观察C.albicans内部细胞壁、细胞膜形态的变化。

1.2.5Mt-22S3对C.albicans细胞膜通透性的作用 取对数生长期的C.albicans菌悬液,与终浓度为0、125、250 及 500 mg/L Mt-22S3作用,置于37 ℃温箱培养12 h,4 000 r/min离心5 min,获取C.albicans菌体,PBS缓冲液(pH=7.4)洗涤3次,弃上清,保留菌体沉淀物;各组加碘化丙啶(propidium iodide,PI)溶液,使终浓度为10 mg/L,混匀,置于37 ℃培养箱避光染色5 min;无菌PBS缓冲液(pH=7.4)洗涤3次,重悬菌悬液;使用正置荧光显微镜于535 nm激发光、615 nm发射光下观察细胞膜通透性的变化。

1.2.6Mt-22S3对C.albicans细胞壁及细胞膜麦角甾醇合成相关基因扩增引物的合成 参照文献[16-17]中的内参基因[肌动蛋白1基因(actin 1,ACT1)],细胞壁合成相关基因[几丁质合成酶基因1(chitin synthase gene 1,CHS1)、几丁质合成酶基因2(chitin synthase gene 2,CHS2)、几丁质合成酶基因3(chitin synthase gene 3,CHS3)、β-葡聚糖合成相关蛋白KRE1基因 (beta-glucan synthesis-associated protein kre1 gene,KRE1)、β-葡聚糖合成相关蛋白KRE6基因(beta-glucan synthesis-associated protein kre6 gene,KRE6)及甘露糖蛋白65基因(65-kD mannoprotein gene,MP65)]和细胞膜麦角甾醇合成相关基因[角鲨烯环氧化酶基因(squalene monooxygenase gene,ERG1)、C-22甾醇去饱和酶基因(C-22 sterol desaturase gene,ERG5)、甾醇24-C-甲基转移酶基因(sterol 24-C-methyltransferase gene,ERG6)及5-甲基四氢蝶酰基三谷氨酸-高半胱氨酸甲基转移酶基因 (5-methyltetrahydropteroyltriglutamate-homocysteine S-methyltransferase gene,MET6)]的引物序列,用美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)数据库对引物序列进行比对、验证后,送生工生物工程(上海)有限公司合成,引物详见表1。

表1 C. albicans细胞壁、细胞膜合成相关基因的qPCR反应引物序列

1.2.7Mt-22S3对C.albicans细胞壁及细胞膜麦角甾醇合成相关基因转录水平影响的检测 与终浓度为0、250 mg/L Mt-22S3作用C.albicans24 h,以终浓度为0 mg/L Mt-22S3组为对照组,终浓度为250 mg/L Mt-22S3组为实验组。根据试剂盒方法提取C.albicans的总RNA,以ND2000测定其总量和纯度,取260 nm和280 nm下光密度(optical densit,OD)的比值于1.80～2.20内的 RNA溶液合成互补DNA(complementary DNA,cDNA);参照荧光定量试剂盒说明书在荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real time polymerase chain reaction,qPCR)仪上进行qPCR反应,设置反应程序为:95 ℃ 30 s,95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s、40个循环。实验设置3个重复,C.albicans细胞壁合成相关基因(CHS1、CHS2、CHS3、KRE1、KRE6及MP65)及细胞膜麦角甾醇合成相关基因(ERG1、ERG6、ERG5及MET6)信使RNA(messenger RNA,mRNA)水平的相对表达量依据公式为2-ΔΔCt的相对定量法进行计算,以log2(2-ΔΔCt)为纵坐标、作用时间为横坐标作图。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 Mt-22S3抗C. albicans的活性

抗真菌活性检测结果显示,Mt-22S3抗C.albicansATCC10231的MIC值为125 mg/L,MFC值为250 mg/L;模板肽MAF-1A的MIC值为 625 mg/L,MFC值为1 250 mg/L。

2.2 扫描电镜下C. albicans的细胞形态

经过0 mg/L Mt-22S3处理后,可见菌细胞呈现健康的椭圆形,菌细胞密集且呈现条状,表面光滑;经过125 mg/L的Mt-22S3处理后,大部分菌细胞表面仍然光滑饱满,有少数菌细胞出现皱缩现象;经过250 mg/L的Mt-22S3处理后,大部分菌细胞形态发生不规则改变,表面出现皱缩,菌细胞数量明显减少,且菌细胞表面产生少量气泡状改变;经过500 mg/L的Mt-22S3处理后,菌体形态均发生不规则变化,菌细胞皱缩明显,菌细胞形成数量大量减少,菌细胞表面出现大量气泡状结构见图1。

注：白色箭头代表细胞出现皱缩现象。

2.3 透射电镜下C. albicans细胞形态

0 mg/L Mt-22S3组菌细胞形态结构正常,细胞壁厚度均一,完整光滑,细胞膜连续清晰,胞浆电子密度均匀,细胞器结构正常;125 mg/L Mt-22S3组菌细胞细胞壁结构较完整,细胞膜和细胞壁分离,细胞膜不连续,且胞浆内容物丢失;250 mg/L Mt-22S3组菌细胞细胞壁结构较完整,细胞膜和细胞壁分离,细胞膜松弛,细胞膜上出现孔洞,胞浆内容物丢失,电子密度不均匀;500 mg/L Mt-22S3组菌细胞细胞壁结构仍较完整,细胞膜和细胞壁分离,细胞膜碎裂,胞浆内容物大量丢失,甚至仅剩细胞壁。见图2。

注：黑色箭头指示细胞壁;白色箭头指示细胞膜出现不连续现象。

2.4 细胞膜通透性

125、250、500 mg/L Mt-22S3作用C.albicans后,被荧光染料PI染上红色荧光的C.albicans细胞与0 mg/L Mt-22S3组相比较明显增多,且随着Mt-22S3浓度的升高,产生红色荧光的C.albicans细胞数逐渐增加(图3)。

图3 不同浓度Mt-22S3组对C. albicans细胞膜通透性的影响(PI染色,×1 000)

2.5 细胞壁多糖合成相关基因mRNA表达

实验组C.albicans细胞壁CHS1(t=2.02,P=0.355)、CHS2(t=1.87,P=0.439)、CHS3(t=2.69,P=0.123)、KRE1(t=2.00,P=0.366)、KRE6(t=2.55,P=0.996)及MP65(t=2.11,P=0.362)的mRNA相对表达量与对照组比较,差异均无统计学意义(P>0.05,图4)。

图4 对照组和实验组C. albicans细胞壁合成相关基因mRNA的表达

2.6 细胞膜麦角甾醇相关基因mRNA的表达

实验组C.albicans细胞膜麦角甾醇有关基因ERG1(t=28.26,P<0.000 1)、ERG6(t=21.03,P<0.000 1)、ERG5(t=25.16,P<0.000 1)和MET6(t=26.10,P<0.000 1)mRNA的相应表达量较对照组(0 mg/L Mt-22S3组)明显降低,其中以ERG1表达量降低最为明显(图5)。

注：(1)与对照组比较,P<0.000 1。

3 讨论

目前,研究和开发安全、高效的新型抗真菌药物具有十分重要的意义[19]。C.albicans是人类常见的一种机会致病性真菌,正常可以定植在机体皮肤和黏膜,当机体内菌群失衡以及免疫系统功能下降等情况出现时,C.albicans不仅可引起体表粘膜感染,而且可侵入口腔、胃肠道、阴部等器官,甚至可以侵入血液循环而导致多组织器官的感染[20]。

近年来,C.albicans的耐药性日趋严重,寻找新的抗菌药物成为必然需求[21]。AMPs因其抗菌活性高、不易产生耐药性等特点,从而成为重要的新型抗菌药物候选物之一[22]。Mt-22S3是本课题组通过对模板肽MAF-1A构效优化后所获得一个新型AMPs分子,本研究结果显示,Mt-22S3对C.albicans的 MIC、MFC值分别为125 mg/L和250 mg/L,表明Mt-22S3抗C.albicans活性优于模板肽MAF-1A(MIC为 625 mg/L,MFC为1 250 mg/L),提示Mt-22S3具有新型抗真菌药物的开发潜力。

细胞壁除了维持固有形态的作用外,还可帮助菌细胞抵抗外界物理、化学及生物等多种因素的影响,是保护真菌细胞的重要屏障[23]。真菌细胞壁主要由甘露糖蛋白、β-葡聚糖和几丁质等化学成分组成,有研究发现,某些AMPs能通过与真菌细胞壁多糖成分作用,破坏细胞壁结构来发挥其抗菌作用[7-9]。本研究通过电镜观察发现,C.albicans经不同浓度的Mt-22S3作用后,其细胞壁的完整性未见明显改变,表明Mt-22S3不能直接破坏C.albicans细胞壁的完整性。文献报道,CHS1、CHS2、CHS3是C.albicans几丁质合酶的编码基因[24-25];KRE1、KRE6的编码产物参与β-葡聚糖的生物合成[26];MP65则编码甘露糖蛋白的合成[27]。通过C.albicans细胞壁多糖合成相关基因的mRNA表达检测发现,在Mt-22S3作用前后,CHS1、CHS2、CHS3、KRE1、KRE6及MP65的转录水平无明显变化(P>0.05),表明Mt-22S3不能通过阻碍细胞壁多糖合成发挥抗菌活性,提示对细胞壁的破坏可能不是Mt-22S3抗C.albicans的主要作用机制。

真菌细胞的正常生长繁殖和新陈代谢,离不开细胞膜这一至关重要的生理结构。目前普遍认为,AMPs可以通过破坏真菌细胞膜的完整性而导致真菌细胞死亡。Song等[28]报道,一种新的蝎毒AMPs类似物GK-19可以通过破坏真菌的细胞膜,使真菌细胞膜出现孔洞、破裂,最终导致真菌细胞的死亡。PI是一种核酸染色剂,其作用机制为进入真菌细胞的细胞壁,而不能进入其细胞膜内部。但当细胞膜遭受损伤时,其通透性会显著提高,从而使得PI穿透细胞膜进入细胞内,特异性结合核酸分子,使菌细胞出现红色荧光,因此,可以通过PI实验反映细胞膜的通透性与完整性[16]。本研究结果显示,Mt-22S3作用后的C.albicans细胞内出现红色荧光,并且随着Mt-22S3浓度的增加,发出红色荧光的C.albicans细胞数量逐渐增加,说明PI染料可以穿透经Mt-22S3作用后的C.albicans细胞膜进入到细胞内;同时,透射电镜结果显示,经过Mt-22S3作用后,C.albicans细胞膜与细胞壁发生分离,并且细胞膜出现松弛、不连续、产生孔洞、膜碎裂等细胞改变,以上结果表明Mt-22S3能够破坏C.albicans细胞膜结构的完整性,增加细胞膜的通透性。

麦角甾醇是真菌细胞膜的重要化学组分,可以保持细胞膜结构的完整性、流动性与细胞膜结合酶的活性,参与菌细胞物质交换、细胞分裂等多项重要的生命活动[29-30]。ERG1、ERG5、ERG6及MET6等基因与麦角甾醇合成密切相关,它们是麦角甾醇生物合成途径的重要调控基因,其中ERG1所编码的角鲨烯环氧化酶基因为细胞膜麦角甾醇合成途径中的限速酶,ERG6、ERG5、MET6分别编码的甾醇24-C-甲基转移酶基因、C-22甾醇去饱和酶基因和5-甲基四氢蝶酰基三谷氨酸-高半胱氨酸甲基转移酶基因对细胞膜麦角甾醇的合成具有调节作用[30]。本研究表明,C.albicans经Mt-22S3作用后,其细胞膜麦角甾醇合成相关基因ERG1、ERG5、ERG6及MET6 mRNA表达明显下调(P<0.0001),提示Mt-22S3能抑制C.albicans细胞膜麦角甾醇合成过程,表明Mt-22S3能够通过抑制相关基因mRNA的表达,使C.albicans细胞膜的稳定性破坏,从而发挥其抗C.albicans作用。

综上所述,AMPsMt-22S3可以通过直接破坏细胞膜以及阻碍细胞膜麦角甾醇的合成来发挥其抗C.albicans作用,但细胞壁可能不是Mt-22S3抗C.albicans的主要作用部位。