丹参-川芎嗪配伍前后对急性心肌缺血大鼠体内排泄及Ⅱ相代谢酶的影响*

孙佳,李容,2,勾健,2,潘文琪,3,陆苑,刘春花,黄勇,刘亭**

(1.贵州医科大学 贵州省药物制剂重点实验室,贵州 贵阳 550004; 2.贵州医科大学 药学院,贵州 贵阳 550004; 3.贵州医科大学 临床医学院,贵州 贵阳 550004; 4.贵州医科大学 民族药与中药开发应用教育部工程研究中心 &省部共建药用植物功效与利用国家重点实验室,贵州 贵阳 550004)

急性心肌缺血(acute myocardial infarction,AMI)是一种严重的缺血性心脏病,发病时会出现心脏代谢紊乱、心肌坏死、心律失常以及心肌梗塞[1-3]。参芎葡萄糖注射液(shenxiong glucose injection,SGI)为丹参水提液和盐酸川芎嗪配制而成的复方制剂[4];临床上常用于治疗急性脑梗死、冠心病、心绞痛以及无症状心肌缺血等心脑血管疾病[5-7],其含有的水溶性丹酚酸类成分和盐酸川芎嗪是其发挥抗心血管疾病的活性成分[8-9]。中药复方是中药临床应用的主要形式,配伍通过引起药物代谢酶的改变从而导致药物的吸收、分布、代谢以及排泄(ADME)过程发生变化[10]。课题组在前期研究中发现,与正常组相比,AMI模型大鼠体内川芎嗪的清除率会显著升高[11],可见模型状态对药物的清除有一定影响,因此在病理状态下研究药物配伍前后的体内过程具有更重要的临床意义。而排泄作为药代动力学的最后一个步骤,是指药物及其代谢产物从体内清除的过程[12],对药物疗效、毒副作用以及药物疗效持续时间具有一定影响[13];同时通过研究药物配伍前后的排泄情况,可进一步完善配伍前后的体内过程研究,从药物消除的角度阐明其配伍机制。人体内参与Ⅱ相代谢的酶主要包括UDP-葡萄糖醛酸转移酶(UDP-glucurosyl-transferases,UGTs)、谷胱甘肽S转移酶(glutathione S-transferases,GSTs)、磺基转硫酶、甲基化转移酶和N-乙酰基转移酶等[14-15]。药物在Ⅰ相代谢中进行氧化、还原或水解反应,经Ⅱ相UGT酶发生葡萄醛酸化结合反应后生成的化合物亲水性增强,进而更好地从尿液或胆汁排出体外[16]。实验室前期考察了单次静脉注射SGI、DGI、LGI后Ⅰ相代谢酶的表达及其对药动行为的影响[17],但目前SGI配伍前后在病理状态下的排泄及Ⅱ相代谢酶表达情况尚未见文献报道,故本实验以制剂中含量较高的丹参素和川芎嗪为检测指标,采用超高效液相-串联质谱(ultra high performance liquid phase tandem mass spectrometry,UPLC-MS/MS)法测定丹参素和川芎嗪在AMI大鼠尿液和粪便中的含量,从UGT酶表达的角度分析配伍前后各成分在大鼠体内的排泄差异机制,对SGI的临床合理用药提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1实验动物 健康的SPF级雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠,体质量为230～250 g,购自长沙市天勤生物技术有限公司,合格证号为SCXK(湘)2019-0014,实验伦理审查编号1801210。按前期课题考察的造模和验证方法进行AMI模型大鼠的制备和评价[18],按50 mg/kg剂量皮下注射盐酸异丙肾上腺素溶液,1次/d,连续给药2 d制备AMI模型大鼠,并随机抽取6只大鼠进行模型验证[观察大鼠心电图ST段,测定血清中血清乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)、肌酸磷酸激酶同工酶(creatine phosphokinase isoenzyme,CK-MB)的含量]。

1.1.2仪器 ACQUITY UPLC I-Class/Xevo TQ-S超高效液相串联三重四极杆联用仪(TQS,美国Waters)、ACQUITY UPLC-TQD 超高效液相串联三重四极杆联用仪(TQD,美国Waters),MTN-2800D氮吹浓缩仪(天津奥特赛恩斯),Allegra 64R低温高速离心机(美国Beckman Coulter),代谢笼(意大利 Tecniplast ),WP-UP-WF-20微量分析型超纯水机(四川沃特尔),GBOXChemiXL1.4 凝胶成像仪(英国Syngene),Variouskan LUX多功能酶标仪(美国Thermo Fisher Scientific ),PowerPac Basic 电泳仪(美国 Bio-Rad),Trans-Blot Turbo 蛋白快速转印仪(美国Bio-Rad),微量移液枪(德国Eppendorf)。

1.1.3材料 盐酸异丙肾上腺素(纯度≥99%,批号G2028261)购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司,丹参浸膏(批号07200801)购于贵州景峰注射剂有限公司,木犀草苷对照品(纯度≥98%,批号AF20072618)购于成都埃法生物科技有限公司,盐酸川芎嗪、丹参素、葛根素对照品(纯度≥98%,批号分别为X08O9C71471、H09N10S102463、S02M9B54875)均购于上海源叶生物科技公司,辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗(批号ab205718)、鼠二抗(ab205719)、磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogen,GAPDH)单克隆抗体(批号ab8245)、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶1A1(UDP-glucurosyl-transferases 1A1,UGT1A1)一抗(批号ab194697)、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶1A6(UDP-glucurosyl-transferases 1A6,UGT1A6)一抗(批号ab97646)均购于美国 Abcam 公司,特超敏ECL化学发光试剂盒(批号P0018AS)购于上海碧云天生物技术有限公司,乙腈、甲醇为色谱纯购于德国Merck公司,其余试剂均为分析纯。

1.2 研究方法

1.2.1SGI、丹参注射液、川芎嗪注射液、空白注射液的配制 按照 SGI 国家药品标准“处方”、“制法”项下进行注射液的配制,分别精密称取丹参浸膏、川芎嗪后按标准加入甘油、葡萄糖、注射用水,用盐酸调pH至5.5～6.5,配制成SGI、丹参注射液(danshen injection,DGI,不含川芎嗪)、川芎嗪注射液(ligustrazine injection,LGI,不含丹参浸膏)、空白注射液(不含丹参浸膏、川芎嗪),并进行过滤,灭菌(115 ℃,30 min)。

1.2.2对照品溶液的配制 精密称取丹参素、盐酸川芎嗪、木犀草苷(TQD内标)、葛根素(TQS内标)对照品适量,甲醇定容,配制得丹参素(1 030 mg/L)、川芎嗪(9 986 mg/L)、木犀草苷(1 052 mg/L)、葛根素(1 023 mg/L)的储备液,于-20 ℃保存备用。分别精密量取适量丹参素、川芎嗪对照品储备液,50%甲醇稀释得65.920 mg/L、14.979 mg/L的混合对照品母液,再用50%甲醇2倍逐级稀释得到不同浓度梯度的混合对照品工作液。

1.2.3盐酸异丙肾上腺素溶液的配制 精密称取盐酸异丙肾上腺素0.1g于10 mL量瓶中,用生理盐水充分溶解并定容至刻度,即得质量浓度为10 g/L的盐酸异丙肾上腺素溶液,现配现用。

1.2.4色谱条件 各成分均采用实验室前期建立的色谱条件和质谱条件[17]。Waters BEH C18色谱柱(2.1 mm×50 mm,1.7 μm),Waters Van Guard BEH C18保护柱,流动相为0.1%甲酸水(A)-0.1%甲酸乙腈(B),梯度洗脱:0～1.0 min,92% A;1.0～1.5 min,92%至70% A;1.5～2.0 min,70%至60% A;2.0～2.5 min,60%至10% A;2.5～3.0 min,10% A;3.0～4.0 min,10%至92% A;柱温40 ℃,进样体积为1 μL,流速0.35 mL/min。

1.2.5质谱条件 由于 SGI 中丹参素与川芎嗪在仪器中响应差别较大,故本实验中川芎嗪采用 TQD 检测,丹参素采用 TQS 检测。采用电喷雾电离源(ESI)正、负离子同步监测,多反应监测(MRM)模式,离子源温度120 ℃,毛细管电离电压 3 kV,去溶剂气温度 350 ℃,去溶剂气流速 650 L/h,喷雾气与反吹气为N2,反吹气流速50 L/h,碰撞气为氩气,碰撞气流速0.16 mL/min,丹参素、川芎嗪及内标的质谱参数见表1。

表1 待测成分及内标的质谱参数

1.2.6AMI模型大鼠尿液及粪便样品的收集 取AMI模型大鼠18只,分为3组(n=6),分别饲养于代谢笼中,收集空白尿液及粪便。根据SGI临床用药剂量换算成大鼠给药剂量,按10 mL/kg剂量分别给大鼠尾静脉注射SGI、DGI、LGI(相当于丹参素3.78 mg/kg、川芎嗪13.68 mg/kg)。收集给药后0～4 h、4～6 h、6～8 h、8～12 h、12～24 h、24～36 h、36～48 h时间段尿液及粪便,并记录尿液体积以及烘干后粪便的重量。于-20 ℃保存,备用。

1.2.7尿液样品处理方法 取200 μL尿液于2 mL 离心管,再加入20 μL内标(葛根素1.02 mg/L,木犀草苷157.80 mg/L)、60 μL盐酸(1 mol/L)、1 mL乙腈,涡旋超声,4 ℃下14 000 r/min离心10 min,得上清液a;沉淀中加入1 mL乙腈,涡旋超声,4 ℃下14 000 r/min离心10 min,得上清液b;合并a、b液后氮气吹干,残渣加入50%甲醇200 μL涡旋溶解,4 ℃下15 000 r/min离心10 min,上清液进样分析。

1.2.8粪便样品处理方法 取烘干后粪便样品0.2 g,加生理盐水800 μL,制成25%的匀浆液,涡旋超声,4 ℃下14 000 r/min离心10 min,取上清液200 μL置于2 mL离心管,其余同尿液处理方法“1.2.7”项下操作。

1.2.9Western blotting 测定大鼠肝脏中UGT1A1、UGT1A6蛋白的表达量 另取24只AMI模型大鼠,分为SGI组、DGI组、LGI组、空白溶剂组(n=6),每组大鼠给药3 h后断颈处死,按照前期考察的样品处理方法进行肝微粒体的制备[17]。取等量总蛋白上样,用SDS-PAGE 电泳分离总蛋白后转膜,5%BSA室温封闭3 h,加入UGT1A1一抗(1∶1 000)、UGT1A6一抗(1∶5 000)、GAPDH抗体(1∶5 000),4 ℃下过夜。TBST洗涤5次,每次5 min,加入二抗,室温下孵育2 h;TBST洗涤5次,每次5 min,加入发光液,凝胶成像仪曝光,拍照保存。使用 Quantity one 凝胶图像分析系统进行灰度值分析,计算目的蛋白与内参蛋白(GADPH)的灰度值比值。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 方法学考察

2.1.1专属性 分别制备尿液、粪便空白样品,空白加对照品及给药后的含药样品,按“1.2.7”“1.2.8”项下操作,进样分析获得相应色谱图,结果表明,木犀草苷、川芎嗪、葛根素、丹参素的保留时间分别为1.57、1.09、1.15、0.74 min,各成分分离度和峰形良好,被测物和内标物的测定不受生物样品中内源性物质的干扰。

2.1.2标准曲线和定量下线 取空白尿液、粪便样品各200 μL,分别加入“1.2.2”项下不同浓度梯度的混合对照品工作液20 μL,再按“1.2.7”“1.2.8”项下方法操作,以待测成分峰面积与内标峰面积的比值(A/Ai)为纵坐标(Y),各成分的浓度(C)为横坐标(X),并以1/X2为权重系数,求得回归方程。所得标准曲线的相关系数(R2)>0.999 0。2个成分的标准曲线方程、线性范围及定量下限见表2。

表2 2个成分在大鼠尿液、粪便中的标准曲线

2.1.3准确度和精密度 取空白尿液、粪便样品各200 μL,加入高、中、低3个浓度的混合对照品溶液,再按“1.2.7”“1.2.8”项下方法操作,每个浓度5个样本,连续进样3 d,计算准确度和精密度。2个成分在各排泄样品中的日内、日间精密度RSD值均<15%,准确度范围为88.64%～99.48%,提示该方法准确度、精密度良好,结果见表3。

表3 2个成分在大鼠尿液、粪便中的准确度、精密度

2.1.4提取回收率和基质效应 取空白尿液、粪便样品各200 μL,加入高、中、低3个浓度的混合对照品溶液,再按“1.2.7”“1.2.8”项下方法操作,测得峰面积A;将尿液、粪便样品各200 μL按“1.2.7”“1.2.8”项下方法操作得到的上清液加入高、中、低3个浓度的混合对照品溶液及内标溶液,吹干后加入200 μL流动相复溶,离心取上清液进样分析测得峰面积B;以流动相代替空白尿液、粪便,加入高、中、低3个浓度的混合对照品溶液,进样分析测得峰面积C。提取回收率=A/B×100%,基质效应=B/C×100%。2个成分的提取回收率和基质效应分别在96.91%～101.68%、94.36%～102.89%,RSD均<15%,结果见表4。

表4 2个成分在大鼠尿液、粪便中的提取回收率和基质效应

2.1.5样品稳定性 配制高、中、低3个浓度的混合对照品溶液,考察在自动进样器放置24 h,-20 ℃冻存30 d,经3次冻融(-20 ℃至室温)循环后的稳定性。结果显示在这3种条件下样品均比较稳定,符合生物样品测试要求,结果见表5。

表5 2个成分在大鼠尿液、粪便中的稳定性

2.2 排泄实验结果

AMI模型大鼠静脉注射SGI、DGI、LGI后,SGI组中丹参素经尿液、粪便的累积排泄量分别为(304.586±7.430)μg、(60.530±11.931)μg,累积排泄率分别为(31.354±2.096)%、(6.077±0.955)%;川芎嗪经尿液、粪便的累积排泄量分别为(23.948±0.734)μg、(1.423±0.043)μg,累积排泄率分别为(0.517±0.034)%、(0.032±0.001)%。DGI组中丹参素经尿液、粪便的累积排泄量分别为(313.504±6.205)μg、(47.835±7.658)μg,累积排泄率分别为(33.270±1.297)%、(4.525±0.765)%;LGI组中川芎嗪经尿液、粪便的累积排泄量分别为(44.148±1.001)μg、(2.978±0.066)μg,累积排泄率分别为(0.995±0.066)%、(0.077±0.006)%。见表6。

表6 丹参素、川芎嗪在尿液、粪便中的累积排泄百分率

2.3 不同给药组对UGT1A1、UGT1A6蛋白表达的影响

SGI组中UGT1A1、UGT1A6蛋白的表达量分别为0.228±0.042、1.051±0.092,DGI组中UGT1A1、UGT1A6蛋白的表达量分别为0.155±0.002、0.727±0.019,LGI组中UGT1A1、UGT1A6蛋白的表达量分别为0.177±0.008、0.582±0.019。与DGI组相比,SGI组UGT1A1、UGT1A6蛋白的表达量均升高(P<0.05,P<0.01);与LGI组相比,SGI组中UGT1A6蛋白的表达量明显增加(P<0.001),UGT1A1蛋白的表达量有增高趋势,但差异无统计学意义(P>0.05)。见图1。

注：A为Western blot电泳条带,B为Western blot统计结果;与DGI组比较,(1)P<0.05,(2)P<0.01;(3)与LGI组比较,P<0.001。

3 讨论

本课题基于AMI 模型大鼠静脉注射SGI、DGI、LGI后,分别收集给药后不同时间段的尿液、粪便样品,样品前处理后经 UPLC-MS/MS 分析,结果显示,丹参素经尿液的累积排泄率为31%～33%,是其排泄的主要途径;川芎嗪经尿液、粪便的排泄量很少,累积排泄率均不足1%。2个成分在给药后0～4 h或12～24 h达到排泄高峰;在给药后24～36 h或36～48 h时,各成分在尿液和粪便中基本排泄完全,不存在较长时间的蓄积现象。从配伍前后的累积排泄量结果可知,丹参素在配伍后经尿液的排泄量降低,经粪便的排泄量增加,整体改变无显著性差异;川芎嗪在配伍后整体排泄量均显著降低,在尿液和粪便中的排泄达峰时间前移。这与丹参素的药动学过程改变无显著性差异,配伍后川芎嗪的药时曲线下面积(area under the curve,AUC)显著降低,体内分布变广、消除加快[17]的药动结果一致。

中药配伍使用一方面可以诱导药物代谢酶和外排转运蛋白的表达,加速药物代谢和排泄,减少有毒药物在某一器官的分布、积累和暴露,从而减弱有毒药物对机体的影响[19]。如Kim等[20]研究发现,甘草中的黄酮类苷元甘草素可显著诱导肝细胞外排转运蛋白和主要的Ⅱ相代谢酶UGTs和GSTs的表达,促进有毒物质的胆汁排泄而起到保肝作用。另一方面,也可通过对代谢酶的抑制调控作用,从而显著改变主要药效成分的体内药动学特征,进而影响整体药效。Shi等[21]研究表明,与单体给药相比,静脉注射灯盏细辛注射液能增加显著灯盏乙素的血浆暴露量以及胆汁和尿液的排泄量,且能提高其在脑组织的分布,其机制可能是注射液中芹菜素-7-O葡萄糖醛酸苷和咖啡酰奎宁酸酯抑制了β-葡萄糖醛酸转移酶和有机阴离子转运多肽2B1的活性,降低了灯盏乙素的水解和转运,从而引起药动行为改变而达到神经保护作用。可见,中药的合理配伍使用可通过影响代谢酶和转运体的活性及表达从而改变相关药动行为,进而起到更好的治疗效果。

有研究表明川芎嗪以原型形式排出体外的量极少[22],推测其存在广泛的代谢途径。川芎嗪在体内有多种代谢产物[23],而作为参与川芎嗪Ⅰ相氧化代谢的主要细胞色素P450(cytochrome P450,CYP)同工酶中的主要亚型CYP3A4、CYP2C9 和 CYP1A2,介导了川芎嗪的活性代谢产物2-羟甲基-3,5,6-三甲基吡嗪(HTMP)的生成[24],UGT是人体Ⅱ相反应中最重要的酶之一[25],其中的UGT1A1和UGT1A6作为UGT的亚型,进一步介导了HTMP葡萄醛酸结合反应[26],通过形成葡萄糖醛酸苷进而促进药物的排泄。据报道,发现丹参与川芎嗪配伍后,参与川芎嗪Ⅰ相代谢的同工酶CYP1A2、CYP2C11以及CYP3A2的表达相对单方显著增加[17],可见川芎嗪-丹参配伍后加快了川芎嗪代谢产物的生成,包括其中的活性代谢产物HTMP;通过对药物代谢酶介导的排泄机制研究发现,参与HTMPⅡ相反应的UGT1A1和UGT1A6 在SGI组中的表达均显著增加,提示丹参与川芎嗪合用后会加快HTMP的葡萄醛酸化进程,促进HTMP排出体外,推测这是配伍后川芎嗪原型排泄量降低的原因之一。

药物的排泄与药效强度及毒副作用等密切相关,且药物的排泄过程直接影响药物在体内的血药浓度和药效持续时间。当药物排泄量增大时,血中药量减少,会导致药效降低,却忽视了药物的靶器官分布、及活性代谢产物等影响因素。前期研究发现川芎嗪和丹参联用后,单次给药的情况下,川芎嗪在血中含量降低,代谢加快[17],推测原型成分并非其发挥药效的主要原因;而Ⅰ相、Ⅱ相代谢酶的高表达,从代谢平衡的角度增加了活性代谢产物的生成,推测在川芎嗪和丹参的配伍中活性代谢产物HTMP是其发挥药效的主要因素之一。