异藤黄酚对急性淋巴细胞白血病Jurkat细胞增殖和凋亡的影响及机制*

刘琴,杨坤,牛振鹏,韦学耐,宋晶睿,饶青,黄裕兵,苑春茂,李艳梅***

(1.贵州医科大学 药学院,贵州 贵阳 550004; 2.贵州省天然产物研究中心,贵州 贵阳 550014; 3.贵州医科大学 省部共建药用植物功效与利用国家重点实验室,贵州 贵阳 550014; 4.贵州医科大学 基础医学院,贵州 贵阳 550004)

急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia,ALL)是一种侵袭性血液系统恶性疾病,是最常见的儿科恶性肿瘤,也是导致儿童死亡的主要病因[1-2]。目前,临床上用于治疗ALL的药物主要有长春新碱、类固醇激素及蒽环类药物等[3]。在过去,ALL是一种难治性的血液系统恶性疾病,近年来随着个体化治疗的普及,其治愈率有所提高,但复发和化疗耐药仍然是临床治疗ALL的主要难题[4]。因此,研发新型抗ALL的药物对临床治疗意义重大。来源于藤黄科植物的化合物具有结构新颖及生物活性广泛的特点,近年来成为植物化学及药理学研究的热点之一[5]。木竹子(GarciniamultifloraChamp.ex Benth.)又称多花山竹子,属于藤黄科藤黄属植物,是一种传统中药材,在中医治疗中,常以果实入药,味甘、性凉,具有清热、生津功效[6]。异藤黄酚(isogarcinol,ISO)是从木竹子中提取分离得到的天然小分子化合物,有研究报道ISO具有抗菌、抗炎及抗肿瘤活性[7-10],但对ALL Jurkat细胞的影响未见相关报道。因此,本研究主要探讨ISO对Jurkat细胞增殖及凋亡的影响,并进一步探究其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1细胞株 人ALL Jurkat细胞和人正常肝细胞HL-7702购买于美国细胞培养物收藏中心(American Type Culture Collection,ATCC),由贵州省天然产物研究中心保存。

1.1.2主要试剂 二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)蛋白定量试剂盒、噻唑蓝(thiazolyl blue tetrazolium bromide,DMSO)购自北京索莱宝科技有限公司,三联夜(十二烷基硫酸钠50 g溶解于适量双蒸水,加异丁醇25 mL和浓盐酸 0.5 mL,再加双蒸水至500 mL配置而成),洛斯维·帕克纪念研究所(Roswell Park Memorial Institute,RPMI)1640培养液(美国Gibco公司),胎牛血清(美国BI公司),线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,MMP)检测试剂盒和Hoechst 33258染色试剂盒(江苏碧云天生物公司),β-肌动蛋白(β-actin)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(cysteine aspartate protease 3,Caspase3)、剪切的Caspase3(Cleaved Caspase3,Cleaved-caspase3)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9(cysteine aspartate protease 9,Caspase9)、剪切的Caspase9(Cleaved Caspase9,Cleaved-caspase9)、凋亡蛋白酶活化因子-1(apoptotic protease activating factor-1,Apaf-1)、细胞色素C(cytochrome c,Cytc)、蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)、磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)、磷酸化PI3K(phosphorylated PI3K,p-PI3K)、重组人BH3结构域凋亡诱导蛋白(recombinant human BH3 domain apoptosis-inducing protein,Bid)、截断的Bid(truncated Bid,t-Bid)、磷酸化的信号转导和转录激活因子-3(phosphorylated signal Transducer and Activator of Transcription 3,p-STAT3)、Janus激酶2(janus kinase 2,JAK2)、磷酸化JAK2(phosphorylated JAK2,p-JAK2)、多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(polyadenosine diphosphate ribose polymerase,PARP)、剪切的PARP(cleaved PARP,Cleaved-PARP)、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,p38)一抗及异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)标记的二抗(美国CST公司),磷酸化的蛋白激酶B(phosphorylated protein kinase B,p-Akt)一抗(美国SAB公司),细胞骨髓瘤病毒癌基因(cellular myelocytomatosis viral oncogene,c-Myc;英国Abcam公司),信号转导和转录激活因子-3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3;杭州华安生物技术有限公司)。

1.1.3主要仪器 Synergy2 酶标仪(美国Biotek公司),流式细胞仪(杭州艾森生物有限公司),倒置荧光显微镜(德国ZEISS公司),凝胶电泳仪(美国BIO-RAD公司),Odyssey CLX 红外成像系统(美国LI-COR公司)。

1.2 研究方法

1.2.1细胞培养 ALL Jurkat细胞使用含5%血清的RPMI 1640培养基,人正常肝细胞HL-7702使用含5%血清的DMEM培养基,于37 ℃、5%的二氧化碳培养箱中培养。

1.2.2MTT法检测细胞活力 采用MTT法检测ISO对Jurkat细胞活力的影响,以人正常肝细胞HL-7702作为毒性对照。取“1.2.1”项下对数生长期的Jurkat细胞以1×104个/孔接种于96孔板,取“1.2.1”项下对数生长期的HL-7702细胞以8 000个/孔接种于96孔板,以DMSO为空白对照,用设定浓度的ISO(10、15、20及25 μmol/L)处理Jurkat细胞和HL-7702细胞24、48及72 h,加MTT(10 μL/孔)于37 ℃培养箱避光孵育4 h,再加三联夜(100 μL/孔)置于37 ℃培养箱孵育过夜,酶标仪于570 nm波长处测定各孔的光密度(optical density,OD)值,计算不同时间点的细胞存活率。

1.2.3流式细胞术检测细胞凋亡 取“1.2.1”项下对数生长期的Jurkat细胞,按5×105个/孔接种于6孔板,以DMSO为空白对照,用设定浓度的ISO(10、15及20 μmol/L)处理Jurkat细胞24、48 h,1 500 r/min离心3 min,收集细胞,磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution,PBS)洗涤,加1×Binding Buffer 50 μL重悬细胞,分别加Annexin V-FITC 和碘化丙啶(propidium iodide,PI )2.5 μL,室温避光染色15 min,用流式细胞仪检测细胞的凋亡。

1.2.4Hoechst 33258染色验证ISO对Jurkat细胞凋亡的影响 取“1.2.1”项下对数生长期的Jurkat细胞(5×105个/孔)接种于6孔板,分组及处理同“1.2.3”,24 h后收集细胞,PBS洗涤,加0.5 mL试剂盒中的固定液固定细胞10 min,1 500 r/min离心3 min,去固定液,PBS洗涤,加 Hoechst 33258染色液0.5 mL,避光染色5 min,置于荧光显微镜下观察。

1.2.5MMP检测试剂盒(mitochondrial membrane potential assay kit,JC-1)检测ISO对Jurkat细胞MMP的影响 取“1.2.1”项下对数生长期的Jurkat细胞(5×105个/孔)接种于6孔板,分组及处理同“1.2.3”,24 h后收集细胞,PBS洗涤,加培养液和JC-1染色工作液0.5 mL,混匀,置于细胞培养箱中孵育20 min,1 500 r/min离心3 min,用1×JC-1染色缓冲液洗涤细胞3次,加适量1×JC-1染色缓冲液重悬细胞,于荧光显微镜下观察产生绿色荧光或红色荧光的细胞占比。

1.2.6RNA高通量测序(RNAsequencing,RNA-seq)实验 取“1.2.1”项下对数生长期的Jurkat细胞,按1.5×106个/孔接种于细胞培养皿,分别用DMSO、ISO处理Jurkat细胞24 h,1 500 r/min离心5 min,收集细胞,加Trizol 裂解后送样至武汉华大基因测序公司进行测序分析。

1.2.7Western blot 检测相关蛋白的表达 取“1.2.1”项下对数生长期的Jurkat细胞(1.5×106个/皿)接种于细胞培养皿,分组及处理同“1.2.3”,24 h后收集细胞,加适量的细胞裂解液于冰上裂解45 min,4 ℃下12 000 r/min离心15 min,取上清液(蛋白溶液),BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度,将蛋白溶液与5×Loading Buffer以体积4∶1比例混匀,100 ℃金属浴变性5 min,置于-80 ℃保存备用。用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)分离蛋白50 μg,用湿转法将蛋白转移到聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜上,室温3%牛血清白蛋白溶液封闭1 h,4 ℃下与Caspase3、Cleaved-caspase3、Caspase9、Cleaved-caspase9、PARP、Cleaved-PARP、Apaf-1、Cytc、Akt、p-Akt、PI3K、p-PI3K、p38、p-p38、STAT3、p-STAT3、JAK2、p-JAK2及c-Myc相应一抗孵育过夜,1倍三羟甲基氨基甲烷缓冲盐溶液(tris buffered saline,TBS)洗涤,室温下与带荧光的兔二抗孵育2 h,用红外成像仪对膜进行扫描。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 细胞增殖

MTT检测结果显示(图1A和1B),ISO能以时间-浓度依赖方式使Jurkat细胞活力下降(P<0.05),但对HL-7702细胞活力的影响较小;与DMSO组相比,10、15、20及25 μmol/L ISO组Jurkat细胞活力下降(P<0.05),且具有时间依赖性;与DMSO组相比,10、15、20及25 μmol/L ISO组HL-7702细胞活力无变化(P>0.05)。光学显微镜下观察到ISO处理48 h后,能使Jurkat细胞数量明显减少,且细胞趋于碎片化,但对HL-7702细胞形态和数量的影响较小(图1C),提示ISO可能对Jurkat细胞具有选择性。

注：A为Jurkat细胞存活率,B为HL-7702细胞存活率,C为ISO处理Jurkat细胞和HL-7702细胞48 h后,明视野下的细胞数量及形态(20×);(1)与DMSO组比较,P<0.05。

2.2 细胞凋亡

为了探究ISO能否诱导Jurkat细胞凋亡,采用流式细胞术检测结果如图2 A和2B所示,ISO处理Jurkat细胞24 h和48 h后,与DMSO组相比,10、15 及20 μmol/L ISO组Jurkat细胞凋亡率升高(P<0.05),且具有时间依赖性;Hoechst 33258染色进一步验证ISO对Jurkat 细胞凋亡的影响,结果显示(图2 C),与DMSO组相比,ISO处理Jurkat细胞24 h,荧光显微镜下观察到呈现亮蓝色荧光的细胞数逐渐增多,进一步表明ISO可诱导Jurkat细胞发生凋亡。

注：A为流式细胞术检测Jurkat细胞的凋亡率(颜色越红表示细胞密度越大),B为凋亡率统计分析,C为Hoechst 33258 染色结果(20×,亮蓝色荧光越多表示凋亡细胞越多);(1)与DMSO组比较,P<0.05。

2.3 MMP及凋亡相关蛋白的表达

MMP检测试剂盒JC-1分析ISO对Jurkat细胞MMP的影响,结果显示,ISO处理 Jurkat细胞24 h后,荧光显微镜下观察到产生红色荧光的细胞数逐渐减少,而产生绿色荧光的细胞数逐渐增多,提示MMP下降;Western blot结果显示,ISO 处理 Jurkat 细胞24 h后,与DMSO组相比,10、15及20 μmol/L ISO组Jurkat细胞Cleaved-caspase3、Cleaved-caspase9、Cleaved-PARP、t-Bid、Apaf-1及Cytc的表达增加(P<0.05),Caspase-3、Caspase-9、Bid及PARP的表达无变化(P>0.05),提示ISO通过激活线粒体凋亡途径诱导Jurkat细胞凋亡。见图3。

注：A为JC-1染色结果(20×,红色荧光表示细胞MMP正常,绿色荧光表示细胞MMP下降),B为Western blot检测结果(绿色荧光表示蛋白显影条带,绿色荧光越强,蛋白表达量越高),C、D分别为Caspase3、Cleaved-caspase3、Caspase9、Cleaved-caspase9、PARP、Cleaved-PARP及Bid、t-Bid、Cytc、Apaf-1蛋白的相对表达量;(1)与DMSO组比较,P<0.05。

2.4 ISO对JAK2/STAT3/c-Myc信号通路的影响

Western blot检测ISO对JAK2/STAT3/c-Myc途径相关蛋白表达水平的影响,结果如图4 所示,与DMSO组相比,10、15及20 μmol/L ISO组Jurkat 细胞中p-JAK2、p-STAT3及c-Myc的表达下降(P<0.05),提示ISO以浓度依赖方式下调了p-JAK2、p-STAT3及c-Myc的水平,但JAK2和STAT3的表达无变化(P>0.05),则提示ISO可能通过抑制JAK2/STAT3/c-Myc途径诱导Jurkat细胞凋亡进而抑制其增殖。

注：A为Western blot检测各蛋白的表达结果(绿色荧光表示蛋白显影条带,绿色荧光越强,蛋白表达量越高),B为各蛋白表达的定量结果;(1)与DMSO组比较,P<0.05。

2.5 ISO对PI3K/Akt、p38 MAPK信号通路的影响

RNAseq分析结果如图5A所示,与DMSO组相比,ISO处理Jurkat细胞24 h后,使299个基因上调,57个基因下调;通过Kegg-Pathway富集分析发现,ISO主要影响了Jurkat细胞中MAPK及PI3K/Akt等信号途径(图5B);基于上述结果,采用Western blot 检测ISO对Jurkat细胞PI3K/Akt和MAPK信号通路相关蛋白表达的影响,结果如图5 C和5D所示,与DMSO组相比,10、15及20 μmol/L ISO组Jurkat细胞中p-p38的表达上调(P<0.05),p-PI3K、p-Akt的表达下调(P<0.05),提示ISO可能通过抑制PI3K/Akt通路,激活p38 MAPK通路,促进Jurkat细胞凋亡进而抑制其增殖。

注：A为差异表达基因,B为Kegg-Pathway富集分析结果(颜色越红代表富集相关性越大,颜色越蓝代表富集相关性越小,圈的大小代表基因数的多少,圈越大,基因数越多),C为Western blot检测各蛋白表达的结果(绿色荧光表示蛋白显影条带,绿色荧光越强,蛋白表达量越高),D为各蛋白相对表达量的定量结果统计分析;(1)与DMSO组比较,P<0.05。

3 讨论

ALL是由淋巴祖细胞在骨髓内异常增生和聚集导致的一种恶性肿瘤[11],尽管目前治疗已取得重大进展,但仍有部分患者面临复发和预后不良[12]。因此,寻找新型抗ALL药物对临床ALL的治疗意义重大。天然产物具有结构新颖、多靶点作用的特点,是抗肿瘤药物研发的宝库[13]。本研究结果表明,源于木竹子的天然小分子化合物ISO能明显抑制Jurkat细胞增殖并诱导其凋亡,但对人正常肝细胞HL-7702的影响较小,提示ISO可能是一个低毒高效的天然小分子化合物,具有开发为抗ALL药物的潜力。

细胞凋亡是一个细胞程序性死亡的过程,对维持机体的稳态具有重要作用,凋亡机制缺陷会促进癌症的发生[14]。细胞凋亡主要有3条途径:内质网途径、线粒体途径及死亡受体途径[15-16]。最经典的凋亡途径是线粒体介导的细胞凋亡,MMP的下降直接导致线粒体膜的通透性增大,使Cytc释放到胞质并与Apaf-1结合形成凋亡复合体,启动Caspase级联进而导致细胞凋亡[17]。Caspase家族成员在细胞凋亡过程中具有重要作用,Caspase9被凋亡复合体激活后,将信号传递给Caspase3,其活化后切割PARP进而导致细胞凋亡[18]。本研究结果显示,ISO能上调Cleaved-caspase3、Cleaved-caspase9、Cleaved-PARP、t-Bid、Apaf-1及Cytc的表达,激活线粒体凋亡途径,诱导Jurkat细胞凋亡。

JAK2/STAT3信号通路参与调节细胞增殖、分化、凋亡等多种生物过程[19],该通路的过度激活参与了白血病、肝癌、乳腺癌及胰腺癌等多种癌症的发生发展[20]。c-Myc是一个重要的转录因子,其在多种肿瘤细胞中高表达[21],c-Myc的抑制能明显抑制肿瘤细胞的增殖[22]。越来越多的研究报道,JAK2/STAT3/c-Myc信号通路的异常激活在多种血液系统恶性肿瘤中被认为是支持肿瘤细胞存活、增殖及代谢的关键因素,抑制JAK2/STAT3/c-Myc途径可以抑制T细胞ALL(T-ALL)细胞的增殖并诱导其凋亡[23]。本研究结果表明,天然小分子化合物ISO可抑制Jurkat细胞中JAK2/STAT3/c-Myc信号通路相关蛋白p-STAT3、p-JAK2及c-Myc的表达。

p38 MAPK途径在细胞凋亡及炎症的调节中具有重要作用,激活该通路可以诱导肿瘤细胞的凋亡。研究表明,激活p38 MAPK可以诱导人ALL细胞系Jurkat和Nalm-6的凋亡并抑制其增殖,也可以诱导人肝癌细胞HepG2发生凋亡[24]。PI3K/Akt信号通路在调控细胞的增殖和存活中起着重要作用,许多研究表明,PI3K/Akt信号通路的过度激活与癌症的发生密切相关,且是T-ALL的特征之一[25]。本研究通过RNAseq分析及Western blot检测后结果表明,ISO影响Jurkat细胞中p38 MAPK和PI3K/Akt信号通路相关蛋白p-p38、p-PI3K和p-Akt的表达。

综上所述,本研究表明天然小分子化合物ISO能抑制Jurkat细胞增殖,并通过激活线粒体凋亡途径诱导其凋亡,其机制可能与PI3K/Akt及JAK2/STAT3/c-Myc途径的抑制及p38 MAPK通路的激活有关。但本研究仅对ISO的体外抗白血病活性进行了初步探讨,后续研究将利用基因敲除及过表达技术,寻找ISO抗ALL的潜在靶点,并建立ALL动物模型,进一步验证该化合物的体内活性,明确其抗ALL的效果及作用机制,为ISO开发为抗ALL药物提供实验依据和科学理论基础。