沙库巴曲缬沙坦对血管平滑肌细胞增殖的影响

徐从凤,王妮,赵明明,张宁,王立韧,李永红

(青岛大学附属医院心血管内科,山东 青岛 266100)

缺血性心脏病是目前威胁人类健康的主要原因[1],经皮冠状动脉介入术(PCI)是冠心病病人重要治疗方法,血管支架尤其是药物洗脱支架应用极大程度改善了冠心病病人的疗效和预后[2-3]。然而,该疗法存在支架内再狭窄(ISR)的并发症,严重影响了PCI的疗效,也是目前医学领域面临的尚未解决的难题之一[3]。ISR的病理生理学机制复杂[4],所涉及的主要机制包括血管内皮损伤、血管平滑肌细胞(VSMCs)的增殖和迁移、炎症反应、血管外基质重构等,VSMCs的异常增殖和迁移是冠状动脉粥样硬化和冠状动脉ISR的主要病理基础[5]。沙库巴曲缬沙坦(Entresto)是一种治疗心力衰竭药物[6],主要由血管紧张素受体抑制剂缬沙坦(Valsartan)和脑啡肽酶抑制剂沙库巴曲组成[7]。脑啡肽酶抑制剂沙库巴曲可以抑制脑啡肽酶(NEP)活性,并减少 NEP对利钠肽(NP)以及其他血管活性肽的降解[8]。NP主要包括A型利钠肽(ANP)、B型利钠肽(BNP)、C型利钠肽(CNP),NP与受体结合后能增加细胞内第二信使cGMP的含量,并作用于下游信号通路发挥抑制VSMCs增殖的作用[9-10]。相关研究证明,Valsartan可以通过多条信号通路抑制VSMCs的增殖[11]。目前,Entresto对VSMCs增殖与迁移影响的研究较少。本研究观察Entresto对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)刺激下人主动脉平滑肌细胞(HA-VSMCs)增殖与迁移的影响,探讨Entresto在预防ISR中的作用及机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

HA-VSMCs加入DMEM培养液(含10 g/L青霉素-链霉素和体积分数0.10胎牛血清),培养箱中培养。AngⅡ、Entresto购自AbMole,增殖细胞核抗原(PCNA)、基质金属蛋白酶9(MMP-9)抗体购自上海爱必信生物科技有限公司,CCK8试剂盒、蛋白浓度测定(BCA)试剂盒、ECL化学发光剂、胰蛋白酶、胎牛血清、高糖DMEM培养液等购自大连美仑生物技术有限公司,RNA提取试剂Trizol购自北京博迈斯科技发展有限公司,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)试剂盒来自艾科瑞生物,引物由青岛德罗海达生物技术有限公司合成。

1.2 实验方法

1.2.1实验分组 将HA-VSMCs接种于6孔培养板中,无血清培养液饥饿培养24 h后,按以下方法进行分组处理:AngⅡ组(B组),加入AngⅡ(1×10-6mol/L);AngⅡ+Entresto组(C组),加入Entresto(1×10-5mol/L)作用1 h之后再加入AngⅡ(1×10-6mol/L);对照组(A组),不加AngⅡ和Entresto。各组均培养24 h。

1.2.2CCK8检测细胞增殖 将HA-VSMCs接种在96孔板中,待细胞融合至80%时,换无血清培养液饥饿处理24 h。按1.2.1方法分组并加入相应药物培养24 h,向每孔中加入10 μL CCK8试剂继续培养2 h,在酶标仪上检测450 nm波长处各孔的光密度(OD)值,以其表示细胞增殖活性。每组设 5个复孔,实验重复3次。

1.2.3细胞划痕实验检测细胞迁移活性 将HA-VSMCs接种到6孔板中,待细胞贴壁生长至密度70%～80%时,更换为无血清培养液饥饿处理24 h。使用 1 000 μL的无菌枪头垂直在细胞板上均匀划线,造成几条划痕。PBS 洗涤3次去除划掉的细胞,加含体积分数0.10胎牛血清的DMEM培养液,按1.2.1方法分组并加入相应药物,每隔12 h显微镜下观察细胞划痕开口率,并采集图像。

1.2.4qRT-PCR检测PCNA及MMP-9mRNA表达 HA-VSMCs按照1.2.1方法分组并加入相应药物,培养24 h后弃去培养液,每孔细胞加入500 μL Trizol裂解核蛋白提取总mRNA,应用逆转录试剂盒逆转录得到cDNA;根据SYBR Green Premix Pro Taq HS qPCR Kit说明书将所获得的cDNA进行qRT-PCR,检测PCNA以及MMP-9mRNA表达。PCR引物及其序列见表1。

表1 PCR引物及其序列

1.2.5Western blot检测PCNA及MMP-9蛋白表达 按1.2.1方法分组并加入相应药物,作用24 h后弃去培养液,PBS洗3次后,加含蛋白酶抑制剂的蛋白裂解液充分裂解,应用BCA试剂盒测定蛋白浓度。取20 μg蛋白样品加样,行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳,三明治法转膜,250 mA恒流1 h,应用快速封闭液封闭15 min后洗膜。将膜分别加入PCNA抗体(1∶1 000)、MMP-9抗体(1∶1 000)、β-actin抗体(1∶1 000)中,4 ℃摇床孵育过夜,洗涤后放入二抗(1∶5 000)中室温孵育2 h。采用ECL化学发光方法显影后,在蛋白凝胶成像系统上采集条带,以β-actin进行标定,采用Image J软件对各条带灰度值进行分析,计算各组VSMCs中PCNA及MMP-9蛋白相对表达水平。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 各组VSMCs增殖活性比较

对照组、AngⅡ组及AngⅡ+Entresto组的OD值分别为1.00±0.06、2.08±0.12、1.01±0.12,各组之间相比较差异有统计学意义(F=164.10,P<0.05)。两两比较显示, AngⅡ组VSMCs增殖活性较对照组升高(t=17.67,P<0.05),AngⅡ+En-tresto组VSMCs增殖活性较AngⅡ组降低(t=13.55,P<0.05)。

2.2 各组VSMCs迁移活性比较

划痕实验显示,各组0 h时的划痕开口率差异无显著性(P>0.05),在12～36 h划痕开口率组间差异有统计学意义(F=16.54～58.64,P<0.05)。与对照组相比较,AngⅡ组VSMCs的划痕开口率在12～36 h明显降低(t=4.04～8.78,P<0.05),提示VSMCs的迁移程度增加;与AngⅡ组相比较,AngⅡ+Entresto组VSMCs的划痕开口率在12～36 h更高(t=5.79～9.32,P<0.05)。见图1。

A:各组划痕实验结果;B:各组0～36 h划痕开口率比较。

2.3 各组VSMCs中 PCNA、MMP-9 mRNA和蛋白表达比较

各组VSMCs 中PCNA及MMP-9的mRNA和蛋白表达差异均有显著性(F=33.32～177.20,P<0.05)。与对照组相比较,AngⅡ组VSMCs中PCNA、MMP-9的mRNA和蛋白表达量增加(t=7.07～22.93,P<0.05);与AngⅡ组相比,AngⅡ+Entresto组VSMCs中PCNA、MMP-9的mRNA及蛋白表达均降低(t=5.78～15.82,P<0.05)。见图2和表2。

A:对照组;B:AngⅡ组;C:AngⅡ+Entresto组。

表2 各组VSMCs中PCNA、MMP-9 mRNA及蛋白表达比较

3 讨 论

VSMCs的异常增殖与迁移是ISR最主要的病理生理机制[12]。正常生理情况下,VSMCs存在于血管中膜,组成血管壁结构及调节血管张力以维持血压[13-14]。支架植入术后血管内皮损伤,内膜下成分如胶原纤维、纤维连接蛋白等暴露,使血小板活化,聚集黏附在损伤处形成局部血栓[15]。单核细胞释放炎性介质及趋化因子[16],促进VSMCs由收缩表型转变为合成表型迁入内膜中,细胞的增殖及迁移能力增加[17],VSMCs分泌大量的血小板源性生长因子(PDGF)、α成纤维细胞生长因子、TGF-β等细胞因子及细胞外基质[18],致病理性内膜新生的进程加快,导致ISR的发生。

Entresto主要由沙库巴曲和Valsartan以钠盐复合物1∶1的摩尔比例结合而成[19],这种结合可解决两种病理生理机制:肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)的激活和对NP敏感性的下降[20]。有研究表明,Entresto对来自特发性肺动脉高压病人的人肺动脉平滑肌细胞具有抗增殖作用[21],但是其对HA-VSMCs增殖的影响尚未见有报道。

PCNA是评估细胞增殖状态的常用指标,在细胞各周期中均有表达[22]。MMP-9又被命名为明胶酶B,属于基质金属蛋白酶家族,能够降解血管基膜和细胞外基质[23],是细胞迁移过程中重要的标志指标。已有研究显示,MMP-9的过度表达可以促进VSMCs迁移至血管内膜,减少内膜基质含量[24]。本研究CCK8及细胞迁移实验结果显示,Entresto可以抑制AngⅡ诱导的VSMCs增殖活性及迁移程度,且使PCNA及MMP-9的表达量较AngⅡ组降低。说明Entresto能够抑制AngⅡ诱导的VSMCs增殖及迁移。其可能的作用机制如下。①AngⅡ与AT1受体(AT1R)结合,Valsartan作为AT1R的拮抗剂抑制其促VSMCs增殖与迁移作用[11]。有研究结果表明,Valsartan能够降低AngⅡ诱导的P38丝裂素活化蛋白激酶(MAPK)蛋白表达水平,进而抑制VSMCs的迁移和增殖[25]。除此之外,Notch、PI3K/AKT相关信号通路、TGF-β及下游信号分子、Wnt信号通路等均参与了VSMC的增殖和迁移的过程[26-29],Valsartan可能通过阻断这些通路从而发挥抑制VSMCs增殖的作用。同时,沙库巴曲在抑制脑啡肽酶分解的同时,也抑制了Ang Ⅰ、Ang Ⅱ等多种肽类的降解[30-31],从而使AngⅡ的浓度升高促进VSMCs的增殖。Valsartan很好地弥补了沙库巴曲的缺点[32]。AngⅡ浓度增高可以对抗传统ACE-AngⅡ-AT1轴促VSMCs增殖迁移的作用[33]。②NP除了具有利尿、利钠、扩张血管、抗心肌肥厚和纤维化、抑制RAAS、内皮素和交感神经活性等作用外,NP家族成员ANP、BNP及CNP与受体结合后,均能影响VSMCs的增殖[10]。ANP和CNP可以通过鸟苷酸偶联受体介导降低MAPK活性,两者均可以呈剂量依赖性抑制PDGF诱导的VSMCs增殖[34-35]。相关研究还表明,大鼠过表达CNP可引起cGMP级联激活以诱导G1期VSMCs生长抑制,调节VSMCs表型[36]。BNP可通过鸟苷酸偶联受体A降低细胞内活性氧和NAD(P)H氧化酶的活性,进而抑制AngⅡ诱导的VSMCs增殖[37]。此外,NP还有抑制成纤维细胞增殖及心肌细胞增生肥大的作用[38],故Entresto与支架术后再狭窄的发展过程密切相关,可能会降低支架植入后的再狭窄率。

综上所述,Entresto可抑制VSMCs的移行、增殖,对PCI后再狭窄的防治具有潜在价值。但其具体信号转导机制、体内研究结果及在临床实践中的应用尚有待于进一步探讨。