新型冠状病毒检测方法及其生物传感器的研究进展

李 彤,李胜南,刘贵铭,刘凤海,郭丽双

(牡丹江医学院 1.公共卫生学院;2.学术理论研究部,黑龙江 牡丹江 157011)

新型冠状病毒(SARS-COV-2)自暴发以来不断产生新的变异株。2021年5月,出现Delta(德尔塔)变异株,2021年11月,在南非患者标本中检出B.1.1.529变异株,世界卫生组织(WHO)将其命名为Omicron(奥密克戎)变异株[1]。奥密克戎传染性是普通流感病毒的5倍,迅速成为全球的主流变异株,有咳嗽、发热、头痛、喉咙疼痛以及脑雾等类似流感症状。到现在为止,被WHO认定为高传播性的SARS-CoV-2变异株共有15种,其中包括B.1.617.2、BQ.1和BQ.1.1等,这些变异株可以使病毒更容易传播,具有更高的病毒复制能力和传染性。

迄今为止,人类已经发现了7种冠状病毒,分别是人冠状病毒(HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1)、急性呼吸综合征病毒(SARS-CoV)、中东呼吸综合征病毒(MERS-CoV)和新型冠状病毒。新型冠病毒属于套式病毒目,冠状病毒科,已命名的有Alpha(阿尔法)、贝塔、Gamma(伽玛)、Delta和Omicron共5个属,新冠疫情过程中均已出现。新型冠状病毒为单股正链RNA病毒,表面有特异性蛋白结合标志物,例如膜(Membrane,M蛋白、小包膜(Envelope,E)蛋白、核衣壳(Nucleocapsid,N)蛋白和刺突(Spike,S)蛋白,基因测序发现开放阅读框(opening reading frame,ORF)存在1ab基因、N基因和E基因高度保守序列[2],通常作为新冠病毒检验的识别靶点,本文对新型冠状病毒检测方法进行综述。

1 主要检测方法

新型冠状病毒常用检测方法包括病原学检测、核酸检测、血清学检测。病原学检测主要是对病原体本身进行的检验,从病人样本中用细胞培养法进行的病原菌本身的分析。对病毒进行了分离、培养和鉴别,并对其进行了电子显微镜的观测,能够在疾病爆发的初期就发现个体身上是否存在病毒,属于最直观的检测方法,方法的缺点是病毒分离难度大、仪器设备价格昂贵。核酸检测通过检测新冠病毒中特异性RNA序列作为病毒诊断的标志物[3],是最值得信赖的检测方法。目前全国抗疫过程中应用最普遍的新型冠状病毒检测方法是逆转录-聚合酶链反应,主要针对新型冠状病毒ORF基因组中的1ab与N基因进行检测,由于Omicron变异位点位于S蛋白,1ab 基因和 N 基因未发生变化,因此,原有的核酸检测方法同样适用于Omicron变异株,方法的灵敏度、特异度没有影响。血清免疫学检测通过配体或特殊物质与新型冠状病毒表面特异性的蛋白标志物结合,呈现肉眼可见的斑点或颜色,方法操作简便,但实验结果的准确度较低,常作为筛选方法(见表1)。

表1 新型冠状病毒主要检测方法

2 生物传感器技术

生物传感器是一种能够将待测生物分子转化为可识别的光学或电学信号进行检测的分析仪器,是目前临床检验诊断新冠病毒开发的热点。该仪器包括以下要素:一是用于识别固定化生物敏感材料的元件,如酶、抗体和抗原、微生物、细胞、组织、核酸及其他生物活性物质;二是高效能的能量换能器(例如氧电极、光敏管、场效应管、压电晶体等),具备高速分析、信号转化的能力。与现有检测方法相比,生物传感器技术具有选择性高、成本低和操作简便等优点,可以有效地检测病毒核酸序列,对开发新冠病毒诊断技术呈现出巨大的潜力,被认为最有可能替代传统检测的方法,适用于早期检测阶段及感染监测。根据反应的原理分类,生物传感器可以划分成电化学生物传感器、压电生物传感器、表面等离子共振生物传感器、场效应晶体管生物传感器等。

2.1 电化学生物传感器利用分析物与电极表面识别元件的相互作用产生电化学信号实现对生物体的检测。电化学生物传感器具有便携性、低成本和简便的前处理的优点,同时也具有稳定性差、抗干扰能力不足和检出限高等缺点,需要进一步的优化和改进才能达到临床应用效果。

电化学生物传感器按其识别元件制备不同,可以分为DNA生物电极传感器和免疫生物电极传感器。Damiati等[10]用生物素-亲和素探针固定玻碳电极表面,差分脉冲伏安法成功检测SARS-CoV-2中ORF1ab序列,检出限达100 fg/mL。Tripathy等[11]用金纳米粒子电沉积于电极表面固定巯基自组装核酸探针,实现检测SARS-CoV-2病毒特异序列,可以实现病毒快速检测。Zhao等[12]在功能化石墨烯表面固定SARS-CoV-2特异序列,用于诊断确诊患者,检出率达85.5%,检出限为200 copies/mL。

针对冠状病毒的四种结构蛋白作为生物受体,可以将特异识别的生物信号转化为所需的电信号,构建电化学免疫生物传感器。Soares等[13]用单层羧甲基壳聚糖膜作为基质,进一步包被S蛋白抗体,与样品中S蛋白结合制备免疫传感器,用交流阻抗法成功检测SARS-CoV-2,检出限达0.179 fg/mL。Mojsoska等[14]使用S蛋白抗体进行功能化石墨烯电极,可以检测20 μg/mL S蛋白的信号,相当于浓度5.5×105PFU/mL SARS-CoV-2,整个检测过程约1 h。Rahmati等[15]将葡萄球菌蛋白 A 固定S蛋白抗体且用Cu2O纳米立方体修饰的丝网印刷电极表面,在20 min内检测到SARS-CoV-2,在0.25 fg/mL～1 μg/mL范围有效测定,检测限为0.04 fg/mL。Kiew等[16]研究了电极表面修饰钯纳米薄膜固定血管紧张素转化酶2用于检测SARS-CoV-2的S蛋白,检出限达0.1 μg/mL,用时仅为21 min。

2.2 石英晶体微天平生物传感器石英晶体微天平(Quartz Crystal Microbalance,QCM)生物传感器的工作原理是利用石英晶体所产生的压电效应,从而实现高效的性能表现,当施加机械作用力于石英晶体时,在施力的方向上产生电势,晶体便会受到相应的作用力从而形成了电场,某些电介质在一定的应力下变形时,材料中的电荷会被极化,并在材料的表层带上电荷,从而制备压电生物传感器。QCM具有低成本、免标记、高灵敏度等优点,同时也存在检测过程中必须引入氧化还原离子对等缺点,因此阻碍了该项技术的开发。

按照压电材料的不同,可以将它们分成三种类型:压电单晶传感器、压电多晶传感器和有机压电材料传感器。其中,压电单晶传感器中石英晶体微天平在SARS-CoV-2检测应用已有报道。Zuo等[17]研制了马多克隆抗体包被QCM用于检测气相痰液中SARS-CoV-2,可在2 min内有效检测出0.6～4 μg/mL病毒抗原。Pandey等[18]通过具有疏水性和带正电荷氨基酸残基的S蛋白的结合位点与带负电荷的羧基电极表面相互吸附实现检测 SARS-CoV-2,灵敏度可达ng级。Narita等[19]阐述了开发压电和磁致伸缩传感器的策略,可以通过输出电压的变化来检测SARS-CoV-2,表现出巨大潜力。Kabir等[20]将S蛋白抗体固定在聚氟乙烯表面构建压电生物传感器实现检测SRAS-CoV-2。

2.3 场效应晶体管生物传感器场效应晶体管(Field Effect Transistor,FET)生物传感器通过调节FET电压改变电场效应可以有效控制FET流过通道的电流大小,当固定在基质上的抗体与抗原结合到其表面时,可引起电荷密度和离子变化,指示出病毒的量,可用于检测DNA、蛋白质、细胞和离子等生物识别物。它具有灵敏度高、分析速度快、无需标记等优点,缺点是电流容量小、耐压低。Seo 等人[21]将SARS-CoV-2的S蛋白的特异性抗体固定于石墨烯单层上,开发了FET生物传感器,实现检测1～100 fg/mL的S蛋白,培养介质中检出限达到1.6×10 pfu/mL。Kang等[22]开发了石墨烯表面固定SARS-CoV-2的S1蛋白抗体FET传感器,实现SARS-CoV-2的检测,检出限达10-18mol/L(相当于10-16 g/mL),并将血清样本的诊断时间降至2 min。Li等[23]将MXene与石墨烯修饰电极表面构建超敏感电子传导层,开发同时检测流感病毒和SARS-CoV-2的FET传感器,线性范围为1 fg/mL～10 pg/mL,平均反应时间仅为50 ms。

2.4 表面等离子共振生物传感器表面等离子共振(Surface Plasmon Resonance,SPR)生物传感器通过激光照射诱导介质表面产生等离子共振,导致反射波衰减现象,增加拉曼效应 (Raman scattering),可以通过传感器芯片进行实时、原位、动态地测量不同生物分子之间相互作用的过程,达到痕量病毒检测的目的。该方法的优点是灵敏度可达pmol甚至fmol级,缺点是方法不稳定容易导致测定结果偏差。Akib等[24]提出了石墨烯基多层(BK 7/Au/PtSe 2/Graphene) 涂层搭建SPR生物传感平台,通过琥珀酰亚胺酯固定S蛋白抗体、特异SRAS-CoV-2探针作为配位体,实现对SRAS-CoV-2检测,检测抗刺突蛋白的SPR角灵敏度达到153.85 °/RIU,SPRF灵敏度达到726.50 THz/RIU,最终检测病毒RNA的SPR角灵敏度达到140.35 °/RIU,SPRF灵敏度达到500 THz/RIU。Lewis等[25]研制在金纳米表面吸附生物素,固定链霉亲和素酰化适配子,建立生物素-亲和素检测平台,实时检测SARS-CoV-2的S1蛋白,动态范围为 1～100 nmol/L,检出限为0.26 nmol/L,响应时间10 min。

3 小结

到现在为止,SARS-CoV-2仍在继续在世界范围内传播,新型冠状病毒感染病毒爆发正处于全球性和持续性两个方面的两难境地。2019年底至今新型冠状病毒的研究与开发已经发展的很快,虽然RT-PCR依然是检测新冠肺炎的一种快捷的检测手段。目前的新冠病毒检验方法在准确率、耗时和特异性等方面存在不同的缺陷,相比之下,生物传感器技术恰好能够弥补这些方面的不足。由于技术尚处于探索阶段,在稳定性、探针制备等许多方面存在不足,契待进一步开发和完善。

从未来检测方法开发的趋势上看,新冠病毒的体外检测产品,除了需要较高特异性和灵敏度以外,快速、成本低和操作简便也十分关键。然而,若想同时实现上述目标并非易事,现已开发的传感器技术难以胜任,大多数体系成本在较高水平,因此难以推广使用。未来,电化学生物传感器的发展方向应当聚焦于以下几个方面:(1)这些微型装置的性能需要进行优化,以达到简洁高效的效果;对程序进行优化,最大程度地降低成本,以易于推广和商业化。(2)通过特定的应用程序和机器,实现对数据的分析和对疾病进展的跟踪。(3)通过开发便携式设备可同时实现目标在线检测和现场快速检测,为患者提供高效、便捷的服务。