绝经后骨质疏松症肾阴虚证关联基因CLCF1启动子区相互作用转录因子的筛选及分析

谢丽华 李生强 陈娟 叶云金 黄景文 陈玄 陈赛楠 葛继荣*

1.福建省中医药科学院骨质疏松证候基因组学研究室,福建 福州 350003 2.福建省中西医结合防治骨质疏松重点实验室(福建省中医药科学院、福建中医药大学附属康复医院),福建 福州 350003

人心肌营养素样细胞因子1(cardiotrophin-like cytokine factor 1,CLCF1)是糖蛋白(gp)130细胞因子家族的成员,位于11号染色体11q13.2位置,CLCF1是一种有效的神经营养因子,B淋巴细胞催化剂,能促进B细胞增殖[1-2]。课题组前期以绝经后骨质疏松症(postmenopausal osteoporosis,PMOP)为研究对象,通过芯片、临床验证及体外过表达实验证实,CLCF1是PMOP肾阴虚证的关联基因,CLCF1可通过调控JAK2/STAT3蛋白、磷酸化水平,达到调控骨代谢的目的[3]。CLCF1 mRNA和蛋白在PMOP肾阴虚证患者中表达下调[4-5],但是具体下调机制尚未清楚。基因的表达调控可在多个层次上进行,其中转录水平的调控是非常重要的环节。转录失调是发病机制的关键,转录因子被认为是极具潜力的治疗作用靶点[6]。因此研究基因的转录因子具有重要的意义。

本实验通过DNA pulldown技术联合质谱鉴定的方法检测对CLCF1启动子区域相互作用的蛋白进行分析,并使用平行反应监视(parallel reaction monitoring,PRM)技术靶向验证转录因子的表达情况。旨在筛选出与CLCF1基因启动子区相互作用的转录因子,对于揭示CLCF1基因表达调控的分子机制具有重要的科学价值。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1细胞株:MG-63成骨样细胞株购自中国科学院上海细胞库。

1.1.2主要试剂:MEMα培养基(11900073,Thermofisher),胎牛血清(10100147,Thermofisher),PCR扩增试剂盒(R011,Takara),DNA回收试剂盒(DP209,天根生化),Protease Inhibitor Cocktail(K1007,Apexbio),Trypsin(VA9000,Promega),甲酸(CAEQ-4-000306-4000,CNW Technologies),乙腈(CAEQ-4-000308-4000,CNW Technologies),引物(上海生工生物有限公司)。

1.2 方法

1.2.1细胞培养:复苏细胞,将MG-63细胞培养在含10%胎牛血清的MEMα培养基中,置于37 ℃、5% CO2培养箱内培养。2 d后细胞融合度为80%,进行传代。

1.2.2DNA pulldown实验:分为实验组和对照组。根据CLCF1碱基序列,设计并合成生物素标记的探针为实验组,非特异性探针作为对照组。从培养好的MG-63细胞沉淀中提取核蛋白。将蛋白与DNA、磁珠孵育过夜,形成蛋白-DNA-磁珠复合物。加入磁珠以及核酸酶,使之消化DNA并被磁珠吸附,得到目的蛋白。将蛋白酶解成肽段,洗脱、真空干燥后,分成两份,一份用于质谱鉴定,另一份用于PRM检测。

1.2.3质谱鉴定及分析:每个样品取5 μL通过nano-UPLC液相系统分离后,在线质谱仪进行质谱分析。LC-MS/MS使用的数据库:MaxQuant(version 1.6.1.0)。蛋白数据库:UNIPROT_Human_2020_06;定量方式为MS1定量。多肽和蛋白水平FDR均控制在0.01;用于定量的多肽仅包括Unique,可变修饰的多肽不用于定量;同时进行iBAQ非标定量。

1.2.4PRM验证差异转录因子:多肽经nano-UPLC液相系统进行分离,在线质谱仪(Q-Exactive)进行质谱分析。采用反相色谱柱(Reprosil-Pur 120 C18-AQ,1.9 μm,Dr.Math)分析。质谱分析时长:120 min/sample,采用正离子检测模式。PRM采集方式为:MS2在m/z @200时分辨率为17500,AGC为5E+4,最大离子注入时间 (Max IT) 200 ms。标准化碰撞能量(NCE)为27%,隔离窗口为2.0 m/z。将所采集的PRM数据导入Skyline进行transition提取。Method match tolerance:0.005 m/z;MS2在m/z@200时分辨率为17500。

1.2.5数据处理和生物信息学分析:数据处理方法参照文献[7],筛选条件为FCa值>log2(1.5),同时满足unique peptide≥2。通过DAVID数据库对差异蛋白进行 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析,P<0.05作为富集结果的筛选标准。

2 结果

2.1 DNA pulldown实验获得的差异蛋白

获得的多肽总数为14 085条,去除常见污染蛋白,获得1 573个蛋白。根据FCa值、unique peptide数,实验组与对照组相比,存在的差异蛋白有251个,部分差异蛋白见表1。

表1 部分差异表达蛋白

2.2 差异蛋白的生物信息学分析

对实验组和对照组筛选出的差异蛋白进行GO、KEGG富集分析。GO包括参与的生物过程(biological process,BP)、细胞组分(cellular component,CC)和分子功能(molecular function,MF)。图1展示了GO、KEGG前5条条目。GO富集结果表明与CLCF1结合的蛋白主要涉及核糖体生物发生、正向调控DNA模板转录等生物学过程,包含转录调节复合物、SWI/SNF超家族型复合物,具有与cAMP应答元件结合、ATP水解活性等分子功能。KEGG通路显示,与CLCF1结合的蛋白主要参与人t细胞白血病病毒1型感染、线粒体自噬、甲状腺激素等信号通路。

图1 差异表达蛋白GO、KEGG富集分析

2.3 PRM检测结果

由于转录因子与启动子的相互作用是基因表达的关键,因此本次PRM实验只验证属于转录因子的蛋白。通过UCSC数据库查找CLCF1基因的启动子序列,输入PROMO数据库,再结合JASPAR数据库,预测CLCF1基因的转录因子。将预测到的转录因子与251个差异蛋白中属于转录因子的蛋白取交集,最后选择count数较高的50个转录因子进行PRM验证。图2显示了5个转录因子的PRM定量图,MG63-CTRL为对照组,MG63-IP为实验组,纵坐标表示二级质谱所有子离子的累积峰面积。从表2可以发现,MAFK、TFE3、MITF、JUNB、FOSL2这5个转录因子表达趋势与DNA pulldown检测结果一致。说明MAFK、TFE3、MITF、JUNB、FOSL2这5个转录因子可能与CLCF1基因启动子区相结合。

图2 转录因子定量图

表2 PRM验证的结果

3 讨论

相关统计显示,随着人口老龄化,我国60岁以上女性骨质疏松症患病率为49%,男性为23%[8]。它已经成为严重影响中老年人群健康的慢病之一。课题组前期临床研究发现CLCF1基因在绝经后女性外周血单个核细胞中的表达水平可以反映骨量或骨量丢失的严重程度[9]。其他学者发现CLCF1不仅影响小鼠间充质干细胞的成骨分化[10],而且还能影响破骨细胞的分化[11]。可见研究CLCF1基因对绝经后骨质疏松症具有重要意义,但CLCF1基因的表达调控机制尚未阐明。

DNA pulldown联合质谱检测方法,为研究基因的转录调控提供了有力的工具。PRM是基于高分辨率、高精度的质谱平台,通过对目标蛋白质进行选择性检测,从而实现对复杂样本中的目标蛋白质、肽段进行定量分析的技术[12]。它是近年新出现的靶向蛋白质组定量方法,灵敏度更佳,提高通量的同时且减少对抗体的依赖性[13]。本研究结果发现在MG-63细胞中共筛选到251个与CLCF1基因启动子区特异性结合的蛋白,通过PRM进一步验证,发现MAFK、TFE3、MITF、JUNB、FOSL2这5个蛋白表达趋势与DNA pulldown检测结果一致,说明MAFK、TFE3、MITF、JUNB、FOSL2这5个转录因子可能与CLCF1基因启动子区相结合。

MAFK属于小Maf家族蛋白,是一种包含碱性亮氨酸拉链的转录因子。有研究报道rs7220711差异结合MAFK转录因子可以调控骨硬化蛋白SOST的表达[14]。FOSL2基因编码亮氨酸拉链蛋白,属于FOS家族。研究表明特异性敲除成骨细胞FOSL2基因的小鼠骨量、骨钙素水平降低,但脂联素水平升高[15]。机制研究发现FOSL2主要通过激活Wnt16促进骨形成并抑制骨吸收[16]。JUNB也是一种包含碱性亮氨酸拉链的转录因子,与FOS家族成员二聚化,形成转录因子复合物AP-1。Zhang等[17]通过整合GEO数据库骨质疏松芯片数据集,发现与低骨密度骨质疏松人群相比,JUNB基因在高骨密度人群中表达水平比较高。Wang等[18]用荧光定量PCR实验证实,骨质疏松患者外周血中JUNB基因表达水平显著高于低于正常组。机制实验表明JUNB参与成肌细胞向成骨细胞的分化,并有助于骨质疏松后的骨修复[19]。

MITF是一种含螺旋-环-螺旋和亮氨酸拉链结构的转录因子。MITF基因是破骨细胞形成后期的关键调控因子,位于M-CSF和RANKL信号通路的下游,这对破骨细胞增殖、分化和功能至关重要[20]。TFE3是免疫球蛋白重链增强子3,MiTF/TFE家族成员之一,与MiTF有着密切的同源性。TFE3基因参与破骨细胞和巨噬细胞分化等生理过程,促进破骨细胞的成熟和融合[21]。在破骨细胞中,TFE3可以调节TRAP、组织蛋白酶K等破骨细胞相关基因的表达[22]。当TFE3和MITF同时敲除时,大鼠会出现严重的骨硬化症,但是只敲除单个基因时并不出现此表型[23]。所有这些研究表明,以上5个转录因子很可能通过调控CLCF1基因影响骨代谢,但具体机制需进一步研究。

综上所述,本研究在DNA pulldown技术联合质谱鉴定的基础上,通过PRM技术初步筛选到MAFK、TFE3、MITF、JUNB、FOSL2这5个转录因子,下一步需要荧光素酶报告基因实验以及染色质免疫共沉淀实验进一步验证转录因子与靶基因CLCF1的关系。本研究为进一步研究CLCF1表达调控的机制提供实验依据和研究方向,并可能为骨质疏松治疗提供治疗作用靶点。