宏基因组二代测序技术在2型糖尿病合并肺部感染患者中的临床应用

牛凯 刘斌

糖尿病是临床常见的慢性代谢性疾病,易并发感染,其中肺部感染约占糖尿病合并感染的45%,病死率可达41%[1]。糖尿病患者肺部感染的病原体种类繁多,不乏多重耐药菌、真菌等[2-3],鉴别诊断较为困难,给临床决策带来极大困扰及挑战,因此确定其病原学尤为重要。传统病原学检测灵敏度差,检测时间长,病原学覆盖面窄[4],而宏基因组二代测序技术(metagenomic Next Generation Sequencing,mNGS)可早期、快速、精准鉴定各种感染性疾病的病原学诊断,此外mNGS技术检测到越来越多的罕见病原体,为部分重症或疑难病例的诊断提供了一种快速有效的策略[5]。本研究回顾性的分析了糖尿病合并肺部感染患者的宏基因二代测序检测的病原学结果,为mNGS的临床应用提供参考。

资料与方法

一、研究对象

回顾性收集2021年11月至2023年3月入住阜阳市人民医院呼吸与危重症医学科的2型糖尿病合并肺部感染患者的临床资料共103例,收集患者的临床资料。病例入选标准:均符合2021年美国糖尿病协会(American Diabetes Association,ADA) 制定的《糖尿病医学诊疗标准》[6];纳入的所有患者符合社区获得性肺炎(community-acquired pneumonia,CAP)[7]或医院获得性肺炎(hospital-acquired pneumonia,HAP)[8]或重症肺炎的诊断标准[8],且患者签署纤支镜下肺泡灌洗术知情同意书及 NGS检测知情同意书。排除标准:(1)患1型糖尿病、妊娠期糖尿病和特殊类型糖尿病患者。(2)未成年人。(3)样本未通过mNGS质量控制。(4)结合临床资料最终诊断为非肺部感染性疾病。(5)临床资料及实验室资料不完整。本研究符合医学伦理学标准,经阜阳市人民医院伦理委员会审查同意(医伦理审查[2022]14号)。

二、研究方法

所有入组患者均留取肺泡灌洗液、痰液、外周血、胸水、肺组织等标本至少2份,分别送检mNGS和传统培养。传统培养检测:采用法国生物梅里埃生产的VITEK2 COMPACT检测仪进行病原体鉴定,并根据《全国临床检验操作规程》(第 3 版)进行相关操作。mNGS检测:所有标本的mNGS由天津金匙医学科技有限公司合肥实验室完成(执业许可登记号:PDY83828512011417P1202)。通过样本处理、核酸提取、文库构建和测序、生物信息学分析以及结果解读获得mNGS检测阳性结果,检测结果报告在样本送检后的48～72h内获得。因患者经济原因,本研究mNGS仅对DNA进行测序,因此未将RNA病毒纳入分析范围。

三、检测结果判读

参考《中国宏基因组学第二代测序技术检测感染病原体的临床应用专家共识》的推荐意见[9],并最终根据检测结果,结合序列数、化验指标、影像学改变、临床症状及体征及治疗效果,鉴别定植菌及假阳性结果,由经验丰富的3位正高级职称医生进行综合判定,确定致病菌,并进行资料的同步收集。

四、统计分析

使用SPSS 26.0进行数据分析,计量资料使用平均值±标准差表示;计数资料使用n(%)表示,使用配对χ2检验进行统计分析,P<0.05表示差异具有统计学意义。

结 果

一、患者基本特征

共103例患者,其中男性69 (66.9%)例,女性34 (33.1%)例,平均年龄(65.80±12.15)岁。有吸烟史的患者63 (61.2%)例;有饮酒史的患者有44 (42.7%)例;糖尿病病程10年以上的患者有38 (36.9%)例;有肺部基础疾病的患者有43 (41.7%)例;糖化血红蛋白(HbA1c)<7%的患者有25 (24.3%)例;HbA1c≥7%的患者78 (75.7%)例;有慢性心脑血管疾病的患者有42 (40.8%)例(见表1)。

表1 103例患者基本特征

二、两种方法病原体检出分布

103例临床送检样本中有92例肺泡灌洗液,3例痰液,2例胸水,3例血液,3例组织。通过mNGS共检出可供参考的病原体73种,其中细菌47种,真菌10种,病毒16种,其中细菌检出率排前三位的是铜绿假单胞菌(16.94%)、鲍曼不动杆菌(9.60%),嗜麦芽窄食单胞菌(9.03%)(见表2)。传统病原学培养共检出病原体21种,其中细菌 16种,真菌5种;检出率排前三位的是铜绿假单胞菌(25.00%)、鲍曼不动杆菌(15.90%)、嗜麦芽窄食单胞菌(13.63%)(见表3)。同时通过mNGS检出了罕见的致病病原体,如鹦鹉热衣原体、惠普尔养障体、总状毛霉等。

表2 mNGS检测出的病原体分布

表3 传统病原学检测出的病原体分布

三、两种方法检测结果比较

入组的103例患者均行mNGS及传统病原学检测,mNGS检测的阳性率高于传统检测阳性率(81.55%vs42.72%),两种差异具有统计学意义(χ2=33.013,P<0.001)(见表4)。

表4 mNGS与传统检测方法的检测结果

在40例两种检测结果均阳性的病例中,有5例检测结果完全一致,28例部分一致,7例完全不一致(见图1)。

图1 mNGS与传统方法的一致性

四、两种方法检出致病微生物的效能

根据最终临床诊断,mNGS标本中,76份确诊最终病原体(40例细菌感染、13例结核分枝杆菌感染、16例曲霉菌感染、5例毛霉菌感染、1例肺孢子菌感染、1例甲流病毒感染);传统病原学标本中,42份确诊最终病原体(31例细菌感染、6例白色念珠菌感染、5例曲霉菌感染)。mNGS对致病菌的明确率高于传统病原检测(73.78%vs40.77%,P<0.05),但是两者一致性较差(Kappa=0.179<0.4),结果具有统计学意义(χ2=22.933,P<0.001)。以临床最终诊断为金标准,进一步计算两种检测方法的敏感度、特异度、阳性预测值(Positive predictive value,PPV)及阴性预测值(Negative predictive value,NPV),用以评估两种方法的检测效能。结果显示,mNGS敏感度高(92.68%vs51.21%,χ2=31.110,P<0.001),但是特异度低(61.90%vs90.47%,χ2=4.725,P<0.05)(见表5)。

表5 mNGS与传统检测方法的诊断效能

五、mNGS在不同亚组检测阳性率对比

根据入组患者年龄,将≥60岁的患者分为老年组,<60岁分为非老年组;根据入组患者糖尿病病程,将患者分为糖尿病长病程组(≥10年)与糖尿病非长病程组(<10年);根据糖化血红蛋白水平,将患者分为血糖控制良好组(HbA1c<7%)和血糖控制欠佳组(HbA1c≥7%);根据是否合并基础肺疾病,将患者分为肺基础疾病组和无肺基础疾病组。

对各分组mNGS的检测阳性率进行对比分析发现,老年组与非老年组(80.28%vs84.37%,P>0.05)、糖尿病长病程组与糖尿病非长病程组(78.94%vs83.07%,P>0.05)、血糖控制良好组与血糖控制欠佳组(88.00%vs79.48%,P>0.05)之间mNGS的检测阳性率之间无统计学差异,合并肺基础疾病组与无肺基础疾病组(93.02%vs73.33%,P<0.05)之间mNGS的检测阳性率之间有统计学差异(见表6)。

表6 mNGS在各亚组之间的阳性率对比

讨 论

糖尿病是一种临床常见的慢性代谢性疾病,易并发各种感染,其中并发肺部感染的发生率高,是造成糖尿病患者主要死因之一[10]。对于此类患者最主要的问题是如何找到病原学,从而对临床抗感染治疗提供帮助,进一步提高治疗效果,减少死亡率,而传统检测方法有其局限性,mNGS以快速、精准、阳性率高等优势,进一步在感染性疾病中,起到了重要的作用。

本次检出的致病微生物中革兰氏阴性菌在致病菌中占比高,mNGS的阳性检出率明显高于传统的微生物培养(81.55%vs42.72%,P<0.05),与先前国内研究一致[11-12]。进一步分析后发现,革兰氏阴性菌中较常见的致病菌有铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、肺炎克雷伯杆菌等,革兰氏阳性菌中金黄色葡萄球菌及肺炎链球菌较为多见,真菌中曲霉菌多见,病毒感染中人类疱疹病毒常见。在所有检出中,嗜麦芽窄食单胞菌及结核分枝杆菌占比相对较高,这与他人的研究存在差异。观察发现,在16例检出嗜麦芽窄食单胞菌的患者中,有8例诊断为重症肺炎接受RICU治疗,5例既往合并2种及以上基础疾病,大大增加了医院获得性感染风险[13]。此外,结核分枝杆菌在免疫低下人群中才易发展为结核病,而糖尿病患者由于体内多项代谢紊乱对人体免疫功能造成影响,增加了其结核易感性[14]。

在糖尿病合并肺部感染患者中mNGS检测与传统检测方法检测结果的一致性较差,仅有5例检测到的病原体完全一致,主要为铜绿假单胞菌、马红球菌、肺炎链球菌、大肠埃希菌、烟曲霉。分析二者一致性较差可能的原因有:(1)mNGS有更广泛的病原检测谱,对特殊病原体如曲霉、毛霉、耶氏肺孢子菌、分枝杆菌等具有检测优势。(2)mNGS送检样本在收集、操作过程中有污染的可能性。因此,对mNGS检测报告的解读应与临床实际相结合。44例传统检测阴性但mNGS检测阳性,相比之下,在传统培养无法检测到的病原体,mNGS检测具有较高的临床价值。此外,有15例传统检测及mNGS检测结果均阴性,考虑可能原因有:(1)部分患者行病原学检测之前使用抗生素治疗,可能影响病原体的检出率。(2)所有mNGS标本均送至第三方检测机构,延长了上机时间,对病原体的检出有影响。

为进一步了解 mNGS的敏感度、特异度、阳性预测值和阴性预测值,本研究以临床最终诊断为金标准进行比较,结果发现,mNGS的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值分别为92.68%、61.90%、90.47%、68.42%。其中mNGS检测的敏感度高于传统检测方法,但特异度较低,这与既往部分研究结果相似[15-16]。此外,Li等[17]研究发现,mNGS对肺部感染诊断的敏感度高于传统检测方法,特别是对细菌感染、混合感染、病毒感染和肺孢子虫感染的检出率明显较高。本研究中,mNGS的特异度相对较低,主要是因为本研究以最终临床诊断为金标准,结合临床实际判读导致mNGS的假阳性率增高,从而使得 mNGS的特异度和阳性预测价值相对降低。本研究还表明,两种检测方法在鉴定特定真菌感染方面均有其各自的优势,如在本研究中,传统检测方法在检测白色念珠菌及热带念珠菌方面显示出一定优势,而mNGS在曲霉属、毛霉属的检出率更高。既往研究表明,糖尿病是曲霉、毛霉等发病的危险因素[18],对于高度怀疑这几类真菌感染的患者,传统检测方法往往难以检测到或回报结果时间较长,及早行mNGS检测,有利于及时调整抗感染方案[19]。

分组研究发现,在老年组与非老年组(80.28%vs84.37%,P>0.05)、糖尿病长病程组与糖尿病非长病程组(78.94%vs83.07%,P>0.05)、血糖控制良好组与血糖控制欠佳组(88.00%vs79.48%,P>0.05)mNGS检测阳性率无明显差异,但合并肺基础疾病组与无肺基础疾病组(93.02%vs73.33%,P<0.05)mNGS的检测阳性率之间有统计学差异,进一步表明mNGS对合并肺基础疾病的肺部感染患者病原学检出有较高的临床价值。但由于本研究样本量较少,仍需较大样本量进一步研究验证。

本研究亦存在一定的局限性。首先,本研究为单中心回顾性研究,样本量较小,进一步需要多中心、大样本、前瞻性临床研究评估mNGS在2型糖尿病合并肺部感染患者中的应用价值。其次,本研究未对mNGS结果对临床最终治疗决策的影响进行评估。最后,本研究纳入的均为进行过mNGS检测的肺部感染患者,而临床中尚有大部分患者因经济情况未行mNGS检测,故研究本身存在设计上的偏倚,导致感染类型纳入并非全面。

综上所述,mNGS检测在检出阳性率方面优于传统检测方法,尤其是在真菌、病毒、特殊病原体方面。mNGS也有相应的不足,现阶段仍不能替代传统临床诊断检测方法。但在临床病原学检测中,可以作为传统病原学检测的有效补充,对于肺部感染病因难以判断或治疗效果欠佳的患者,建议尽早行mNGS及传统病原学检测,进一步行针对性治疗。