杞蛎还少方改善D-半乳糖致亚急性衰老小鼠性激素水平紊乱与睾丸氧化损伤的效用评价研究

李梦婷,郑慧丽,朱梓强,徐盼,郭盛,钱大玮,朱悦,段金廒

(南京中医药大学中药资源产业化与方剂创新药物国家地方联合工程中心,江苏省中药资源产业化过程协同创新中心,江苏省方剂高技术研究重点实验室,江苏 南京 210023)

统计显示,2020年世界65岁及以上老龄人口数量已占到总人口量的9.40%;而据我国第七次全国人口普查数据显示,60岁和65岁以上人口占总人口的比例已分别达到18.70%和13.50%[1-2]。老龄化社会已经到来,因此,衰老的医学生物学机制以及抗衰老产品开发也成为了研究热点。

女性衰老问题一直广受关注,然而男性衰老问题鲜有研究。随着中老年男子部分雄激素缺乏综合征(Partial androgen deficiency of the aging male,PADAM)这一概念的提出,中老年男性健康所受关注度逐年上升。PADAM俗称男性更年期综合征,是指男性从中年过渡到老年阶段时,由于下丘脑-垂体-睾丸轴功能逐步减退导致血清睾酮的水平下降,引起的一系列临床综合征,包括内分泌紊乱、骨质疏松、心悸失眠、肌力下降、情志抑郁、记忆力衰退、性功能降低等。中老年人群中PADAM患病率约为40%,严重影响身体健康与生活质量[3-4]。

研究显示,雄激素水平的下降与雄激素对受体的敏感性降低是发生PADAM的直接因素,其病理机制与氧化应激损伤导致的睾丸功能细胞凋亡高度相关[5-7]。针对PADAM的治疗,国际公认的方法是睾酮替代疗法(TNT),即补充外源性雄性激素,如十一酸睾酮,以显著改善相关症状。但此类药物会增加心血管疾病、前列腺癌、睡眠呼吸暂停、红细胞增多等风险,致使其在临床应用中受到一定限制[8]。因此,寻找更为安全有效的药物迫在眉睫。

中医学并无对应PADAM的确切诊断病名,临床多将其归属于“虚劳”“阳痿”“脏燥”“郁证”“心悸”“不寐”等病证中,总体认为肾精亏虚,肾气衰竭,精血不足以致阴阳失调为其基本病机[9]。五子衍宗丸出自明代张时彻《摄生众妙方》,方中菟丝子、枸杞子、覆盆子、五味子均可入肾,补肾阳,益肾精;车前子清热利水可防诸药之温热滋腻。诸药合用生精强肾,固本摄精,多用于男子不育、肾虚腰痛。而本研究复方——杞蛎还少方则在五子衍宗丸的基础上,结合PADAM的现代研究认识化裁衍生所得,全方由枸杞子、牡蛎肉、菟丝子、益智仁、五味子、桑椹、三七、肉苁蓉、油菜花粉组成,其中各药味使用剂量以《中华人民共和国药典》2020版的用法用量为依据,并参考文献中各药味具有改善氧化损伤功效的最低有效剂量制定,具有补肾益精,温肾助阳的功能。本研究通过小鼠腹腔注射D-gal建立亚急性衰老动物模型,评价杞蛎还少方对模型小鼠性激素紊乱与睾丸组织氧化损伤的改善作用,并探索其作用机制,为临床应用与药物开发奠定基础。

1 材料

1.1 实验动物

健康雄性SPF级ICR小鼠,105只,体质量20～25 g,购自上海斯莱克实验动物有限责任公司,动物许可证号为:SCXK(沪)2022-0005,动物饲养于南京中医药大学实验动物中心SPF环境中,常规饲养,温度22～25 ℃,湿度40%～70%。本实验获得南京中医药大学动物实验伦理委员会的批准,伦理号为202203A011。

1.2 药材

枸杞子(批号:2109099)为茄科植物宁夏枸杞LyciumbarbarumL.的干燥成熟果实,购自宁夏明德中药饮片有限公司;菟丝子(批号:250200608)为旋花科植物菟丝子CuscutachinensisLam.的干燥成熟种子,益智仁(批号:45200618)为姜科植物益智AlpiniaoxyphyllaMiq.的干燥成熟种子,桑椹(批号10504001)为桑科植物桑MorusalbaL.的干燥果穗,五味子(批号:38211022)为木兰科植物五味子Schisandrachinensis(Turcz.)Baill.的干燥成熟果实,三七(批号11220828)为五加科植物三七Panaxnotoginseng(Burk.) F.H.Chen的干燥根和根茎,肉苁蓉(批号:260200601)为列当科植物肉苁蓉CistanchedeserticolaY.C.Ma的干燥带鳞叶的肉质茎,均购自苏州市天灵中药饮片有限公司;牡蛎肉(生产编号:SC122450502CC626)为牡蛎科动物近江牡蛎OstrearivularisGould 的肉,购自北海开宇网络科技有限公司;油菜花粉(生产编号:SC12641108201156)为十字花科植物油菜BrassicaCampestisLinn.的花粉,购自长葛市立新蜂业有限公司。以上经南京中医药大学段金廒教授鉴定为合格药材。

1.3 仪器

ZNHW数显电热套(上海力辰邦西仪器科技有限公司);Buchi R-210旋转蒸发仪(巩义市予华仪器有限公司);DZ 30-32高速离心机(上海安亭科学仪器厂);全自动样品快速研磨仪(上海净业信发展有限公司);ST60-4微孔板恒温振荡器(杭州米欧仪器有限公司);EnSpire多功能酶标仪(美国PerkinElmer公司);ChemiDoc XRS凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司);Axio Vert.A1荧光倒置显微镜(德国Zeiss公司)。

1.4 试剂

D-半乳糖(D-gal,N13GS167640)购自上海源叶生物科技有限公司;维生素E(111Q031)购自北京索莱宝科技有限公司;金匮肾气丸(21030042)购自北京同仁堂;10%、12.5%PAGE凝胶快速制备试剂盒(03659300)购自上海雅酶生物医药科技有限公司;RIPA裂解液(P0013B)、BCA试剂盒(1221200210506)购自上海碧云天生物技术有限公司;蛋白酶抑制剂Cocktail(HY-K0010)购自南京普诺恩生物技术有限公司;小鼠超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒(20220609)、谷胱甘肽(GSH)试剂盒(20220609)、丙二醛(MDA)试剂盒(20220609)均购自南京建成生物公司研究所;小鼠促性腺激素释放激素(GnRH)酶联免疫分析(ELISA)试剂盒(AF2506-A)、小鼠睾酮(T)ELISA试剂盒(AF2569-A)、小鼠雌二醇(E2)ELISA试剂盒(AF2566-A)、小鼠促卵泡激素(FSH)ELISA试剂盒(AF2555-A)、小鼠黄体生成素(LH)ELISA试剂盒(AF2582-A)购自湖南艾方生物科技有限公司;SuperKineTM增强型抗体稀释液(ATVE07011)购自南京迅贝生物科技有限公司;ECL化学发光液购自上海天能科技有限公司;NF-E2相关因子2(Nrf2) Rabbit antibody(1696-1-AP)、血红素氧合酶-1(HO-1) Rabbit antibody(10701-1-lg)、Caspase-3 Rabbit antibody(66470-2-lg)、β-actin Mouse antibody(66009-1-lg)购自Proteintech公司;Cleaved-Caspase-3 Rabbit mAb(7237S)、Cleaved-Caspase-9 Rabbit antibody(9664S)、Caspase-9 Mouse mAb(9508S)购自CST公司;B细胞淋巴瘤基因-2(Bcl-2)(G2915)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)(F2816)抗体购自Santa Cruz Biotechnology公司;二抗HRP-Linked Anti-Mouse IgG(BA1050)、HRP-Linked Anti-Rabbit IgG(BA1054)购自BOSTER公司;TUNEL试剂盒(7E58I1)购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司。

2 方法

2.1 杞蛎还少方提取物的制备

称取枸杞子6 g,菟丝子5 g,益智仁1.8 g,五味子1.5 g,桑椹5 g,三七3 g,肉苁蓉4 g,牡蛎肉3 g,油菜花粉1 g加8倍量纯水回流提取1.5 h,3次。合并3次提取液,减压浓缩至浓缩液浓度为1 g·mL-1(按生药量折算)。

2.2 动物模型建立及给药

SPF级ICR健康小鼠105只,适应性饲养5 d后称质量,按体质量进行随机分组,每组15只,共7组,分别是空白组(CON)、模型组(MOD)、维生素E组(VE)、金匮肾气丸组(JGSQW)、杞蛎还少方低剂量组(QL-L)、杞蛎还少方中剂量组(QL-M)、杞蛎还少方高剂量组(QL-H)。除空白组外,各组每日腹腔注射600 mg·kg-1的D-gal溶液,连续8周,注射体积为0.01 mL·g-1,空白组每日腹腔注射相同体积的生理盐水。杞蛎还少方提取液用生理盐水分别配制成浓度为0.25、0.5、1 g·mL-1的溶液,金匮肾气丸研磨后加入生理盐水配制成浓度为0.2 g·mL-1的混悬液。造模第11天起,除空白组和模型组外,其余各组每日同时以相应的给药量(表1)进行灌胃给药,给药体积均为0.01 mL·g-1;空白组与模型组给予等体积的生理盐水灌胃。8周后异氟烷麻醉后眼眶取血、摘取睾丸组织,左侧睾丸放入4%多聚甲醛中固定,右侧睾丸放入液氮速冻,后保存于-80 ℃冰箱中待测。

表1 动物分组与给药剂量

2.3 睾丸组织病理形态观察

取固定的睾丸组织,依次进行脱水、石蜡包埋、切片、染色、封片等步骤,完成操作后将切片放置于光学显微镜下拍照,观察其病理学特征。

2.4 性激素水平测定

小鼠眼眶取血后4 ℃条件下,2 797×g离心10 min,取上清(血清)按照ELISA试剂盒所列步骤,测定小鼠血清中T、E2、LH、FSH、GnRH水平。

2.5 氧化应激因子MDA、SOD、GSH测定

小鼠眼眶取血后4 ℃条件下,2 797×g离心10 min,取血清待测。称取一定量的睾丸组织,加入9倍量生理盐水,60 Hz,90 s的条件下通过全自动组织研磨仪制备得组织匀浆,然后4 ℃条件下,2 797×g离心10 min,取上清待测。按试剂盒说明书测定血清与睾丸中SOD活力和GSH、MDA含量。

2.6 TUNEL染色观察睾丸组织凋亡

取睾丸组织石蜡切片进行脱蜡处理,脱蜡结束后按照TUNEL试剂盒说明书上的步骤依次进行操作,封片后于荧光显微镜下观察、拍照,每张切片随机选取5个视野,计算阳性细胞(亮绿色)占总细胞数的比值即为凋亡率。

2.7 Western blot检测Nrf2、HO-1及凋亡蛋白表达

称取各组动物睾丸组织,记录质量,加入9倍量的RIPA裂解液与蛋白酶抑制剂Cocktail(100∶1),组织匀浆后置于冰上裂解30 min,低温离心10 min后取上清。按照BCA试剂盒的操作步骤测定总蛋白含量,浓度拉平后98 ℃加热15 min,使蛋白变性。用10%、12.5%的PAGE凝胶快速制备试剂盒制备凝胶,120 V电泳2 h,Nrf2的转膜时间为120 min,β-actin、Cleaved-Caspase-3、Cleaved-Caspase-9、Caspase-3、Caspase-9、HO-1、Bcl-2、Bax的转膜时间为60 min,5%脱脂奶粉封闭2 h。结束后加入一抗(Nrf2 Rabbit antibody、HO-1 Rabbit antibody、Bcl-2 antibody、Bax antibody稀释比例均为1∶3 000;Cleaved-Caspase-3 Rabbit mAb、Cleaved-Caspase-9 Rabbit antibody、Caspase-3 Rabbit mAb、Caspase-9 Mouse mAb稀释比例均为1∶2 000;β-actin Mouse antibody稀释比例为1∶100 000),4 ℃摇床过夜,孵育二抗(HRP-Linked Anti-Mouse IgG、HRP-Linked Anti-Rabbit IgG稀释比例为1∶10 000),室温孵育1 h,洗膜后使用凝胶成像仪显色曝光。

2.8 统计学方法

3 结果

3.1 杞蛎还少方对D-gal致衰老模型小鼠睾丸组织形态的影响

结果如图1所示。空白组小鼠睾丸组织结构正常,生精上皮完整,基膜内可见排列整齐的各级生精细胞和支持细胞,睾丸间质细胞成群分布。模型组小鼠睾丸组织中生精小管萎缩,生精上皮变薄,生精细胞排列疏松紊乱,睾丸间质细胞间隙扩大,数量减少。杞蛎还少方各剂量组小鼠与模型组小鼠相比,生精上皮变厚,生精细胞层数增多,生精小管界膜完整,睾丸间质细胞数量增多,作用趋势与维生素E与金匮肾气丸组类似,提示杞蛎还少方对衰老模型小鼠睾丸组织损伤具有显著保护作用。

注:A.空白组;B.模型组;C.杞蛎还少方低剂量组;D.杞蛎还少方中剂量组;E.杞蛎还少方高剂量组;F.维生素E组;G.金匮肾气丸组

3.2 杞蛎还少方对D-gal致衰老模型小鼠血清性激素水平的影响

ELISA法检测小鼠血清中性激素的表达水平,结果显示,模型组小鼠血清中T、E2、GnRH的含量与空白组小鼠相比显著下降(P<0.05,P<0.01),LH、FSH显著升高(P<0.01);中、高剂量杞蛎还少方提取物可显著上调模型小鼠血清中的T、E2与GnRH的表达(P<0.05,P<0.01),降低LH、FSH的表达水平(P<0.01)(图2)。各剂量组间未见显著性差异,其作用趋势与维生素E、金匮肾气丸组类似,提示杞蛎还少方可以显著改善亚急性衰老小鼠性激素的表达。

注:CON.空白组;MOD.模型组;QL-L.杞蛎还少方低剂量组;QL-M.杞蛎还少方中剂量组;QL-H.杞蛎还少方高剂量组;VE.维生素E组;JGSQW.金匮肾气丸组;与空白组比较,

3.3 杞蛎还少方对D-gal致衰老模型小鼠血清与睾丸组织氧化应激因子的影响

结果显示,模型组小鼠血清及睾丸组织中MDA表达与空白组小鼠相比显著升高(P<0.01),SOD活力与GSH表达显著下降(P<0.01);杞蛎还少方各剂量组均可提高模型小鼠血清及睾丸组织中的SOD活力及GSH表达(P<0.05,P<0.01),降低MDA表达(P<0.01)(图3)。其中杞蛎还少方中剂量组作用趋势优于高、低剂量组,优于金匮肾气丸组,提示杞蛎还少方提取物可有效减轻小鼠睾丸组织与全身的氧化损伤。

3.4 杞蛎还少方对D-gal致衰老模型小鼠睾丸细胞凋亡的影响

结果如图4所示。模型组小鼠睾丸组织与空白组相比凋亡细胞数目显著增多(P<0.01)。杞蛎还少方各剂量组显著抑制睾丸组织中细胞凋亡(P<0.01),且其作用趋势与维生素E、金匮肾气丸组类似。提示杞蛎还少方可抑制衰老模型小鼠睾丸组织细胞凋亡。

注:CON.空白组;MOD.模型组;QL-L.杞蛎还少方低剂量组;QL-M.杞蛎还少方中剂量组;QL-H.杞蛎还少方高剂量组;VE.维生素E组;JGSQW.金匮肾气丸组;与空白组比较,##P<0.01;与模型组比较,**P<0.01。

3.5 杞蛎还少方对D-gal致衰老模型小鼠睾丸组织凋亡蛋白表达水平的影响

以Western blot法测定各组小鼠睾丸组织凋亡相关蛋白表达发现,模型组小鼠睾丸组织Bcl-2/Bax蛋白表达水平与空白组小鼠相比显著降低(P<0.01),Cleaved-Caspase-3/Caspase-3、Cleaved-Caspase-9/Caspase-9表达水平明显升高(P<0.05,P<0.01)。杞蛎还少方中、高剂量组显著逆转模型小鼠睾丸组织中Bcl-2/Bax蛋白的表达水平(P<0.05,P<0.01),并降低Cleaved-Caspase-3/Caspase-3、Cleaved-Caspase-9/Caspase-9的表达水平(P<0.01)(图5)。结果提示,杞蛎还少方提取物可抑制小鼠睾丸组织细胞凋亡,中剂量组具有较强的作用趋势。

注:CON.空白组;MOD.模型组;QL-L.杞蛎还少方低剂量组;QL-M.杞蛎还少方中剂量组;QL-H.杞蛎还少方高剂量组;VE.维生素E组;JGSQW.金匮肾气丸组;与空白组比较,

3.6 杞蛎还少方对D-gal致衰老模型小鼠睾丸组织Nrf2与HO-1表达水平的影响

采用Western blot检测小鼠睾丸组织的Nrf2与HO-1蛋白表达水平,结果如图6所示。模型组小鼠睾丸组织Nrf2和HO-1蛋白表达水平与空白组小鼠相比显著降低(P<0.05,P<0.01);低、中剂量杞蛎还少方可显著提升小鼠睾丸组织的Nrf2与HO-1蛋白表达水平(P<0.05,P<0.01),中剂量组具有较强作用趋势。提示杞蛎还少方可通过调控Nrf2/HO-1通路保护睾丸细胞免受氧化损伤。

注:CON.空白组;MOD.模型组;QL-L.杞蛎还少方低剂量组;QL-M.杞蛎还少方中剂量组;QL-H.杞蛎还少方高剂量组;VE.维生素E组;JGSQW.金匮肾气丸组;与空白组比较,

4 讨论

PADAM是男性向老年期过渡过程中所出现的一系列症候群,主要包括性功能障碍、情志不畅、骨质疏松、潮热阵汗等[10]。目前关于PADAM的临床治疗大多采用睾酮补充疗法。然而睾酮的合成与分泌受机体下丘脑-垂体-睾丸轴的调控,外源性补充睾酮可能会导致睾丸轴的平衡被打破,且此类药物具有增加心血管疾病发生率、导致前列腺增生甚至癌变等副作用,限制了临床使用[8]。

研究认为雄激素水平低下与雄激素受体的敏感性下降是诱发PADAM症状的基础因素[5]。临床研究发现,PADAM患者明显存在睾丸功能衰退的现象,睾丸作为雄激素合成与分泌的场所,由于衰老导致血管硬化、管壁增厚、供血不足等因素使得睾丸组织产生退行性变化,严重影响睾酮的产生,造成机体代谢紊乱、激素失衡等一系列生理病理变化[11]。此外,临床还发现PADAM患者血清抗氧化酶SOD及非酶类抗氧化物GSH等合成减少,而过氧化物明显升高[12]。过量的ROS抑制Nrf2/HO-1通路引发睾丸氧化损伤[13-15]。过量的ROS亦会抑制抗凋亡因子Bcl-2表达,并刺激促凋亡因子Bax以及凋亡相关蛋白Caspase-3和Caspase-9的表达,诱导睾丸细胞凋亡[16-17]。由此可知,衰老导致的机体氧自由基堆积引起的睾丸细胞凋亡是PADAM的重要病理机制。本实验采用D-gal造成小鼠机体高氧化态,发现模型小鼠睾丸组织出现了生精细胞与间质细胞数量减少等退行性变化及血清中T水平明显下降,LH、FSH水平显著升高等与PADAM相似的病理特征。在分子水平上亦观察到睾丸细胞出现过度氧化应激的现象,包括睾丸组织中脂质过氧化物MDA含量的显著升高,抗氧化酶SOD活力与抗氧化物GSH水平的降低,Nrf2/HO-1通路作为机体内最重要的抗氧化系统之一,其蛋白表达水平亦呈下调趋势,同时伴随抗凋亡因子Bcl-2水平降低与促凋亡因子Bax、Cleaved-Caspase-3/Caspase-3、Cleaved-Caspase-9/Caspase-9蛋白表达的升高。本研究发现,杞蛎还少方对上述各病理环节均有显著改善作用,能够通过提高亚急性衰老小鼠睾丸组织的抗氧化能力调控性激素的表达水平,延缓PADAM的发生与发展。

《素问·上古天真论》云“丈夫…五八肾气衰,发堕齿槁。六八阳气衰竭于上,面焦,发鬓斑白。七八肝气衰,筋不能动。八八天癸竭,精少,肾脏衰,形体皆极,则齿发去”[18],形象而又高度概括指出肾精枯竭是导致男性衰老的根本原因。“夫精者,身之本也”,肾精作为机体生命活动的本源,其盛衰关系到人体的生长发育、功能代谢以及衰老和多种疾病[19]。因此中医认为,肾精亏虚、肾气虚衰以致机体气血亏虚,阴阳失调是PADAM的病因病机,并相应形成了滋肾填精,益气活血的基本治法[20]。杞蛎还少方在中医著名补肾方剂五子衍宗丸基础上结合现代药理学抗衰老研究成果化裁形成。方中枸杞子益精填髓、补肝肾阴;牡蛎肉滋阴养血,补虚生津,共为君药。肉苁蓉补益精血,润肠通便;菟丝子补益肝肾,温补肾阳;桑椹滋阴补血,生津润燥,为臣药组合。佐以益智仁温肾暖脾,固精缩尿;三七活血散瘀,补虚强壮。使以五味子上益心气,下滋肾阴,可宁心安神,又可以其酸涩之性防肾精与气血耗竭。牡蛎肉咸味又可引诸药入肾经。诸药合用,肾精得充,阴阳得化,五脏得润,六腑得通,共奏益精填髓,补气养血之效。同时加入具有改善前列腺增生效用的油菜花粉,加之牡蛎肉兼有软坚消肿之效,有望对症改善前列腺增生肥大等现象[21]。由于本研究重点评价的是杞蛎还少方的抗氧化作用,所以选择了具有显著抗氧化效用且延缓衰老的维生素E作为阳性对照药。研究发现,杞蛎还少方的抗氧化效应与维生素E相似,提示杞蛎还少方具有显著的抗氧化效应。更为重要的是,杞蛎还少方的组成药味具有改善机体功能的多种效用,且枸杞子、桑椹、益智仁为药食同源中药材,菟丝子、肉苁蓉、三七、五味子属于可用于保健食品中药材,牡蛎肉与油菜花粉可作为普通食品长期食用。因此杞蛎还少方的安全性高,更适合PADAM患者长期调理改善的需要。

已有报道显示,杞蛎还少方中药味具有显著睾丸功能保护作用。枸杞子作为本方的君药,其多糖、甜菜碱、酰胺类成分具有明显的抗氧化、抗衰老功效[22-25],枸杞多糖作为枸杞子的主要功效物质,具有减少小鼠睾丸细胞的凋亡,提高雄激素水平的作用,是枸杞子发挥保健功效的重要物质基础[26]。牡蛎肉的主要成分牡蛎寡肽能够增强细胞的抗氧化能力,促进间质细胞睾酮的合成分泌,可有效防治PADAM[27-28]。菟丝子的主要功效成分菟丝子黄酮能够促进睾丸细胞的增殖[29-30],肉苁蓉的苯乙醇总苷可增强肾阳虚大鼠性能力[31]。三七总皂苷可抑制自然衰老大鼠的睾丸炎症与睾丸生殖细胞凋亡[32]。五味子甲素与油菜花粉总黄酮也具有抗氧化、抗衰老的作用[33-34]。因此杞蛎还少方抑制睾丸组织氧化损伤,改善机体性激素调控网络的紊乱应是方中多种效用成分综合作用的结果。

综上所述,本研究发现杞蛎还少方能够调节亚急性衰老小鼠血清性激素水平,改善睾丸组织病理损伤,该作用可能与其降低睾丸组织氧化应激诱导的细胞凋亡有关。本研究为该方防治PADAM的临床应用提供了现代科学依据,也为相关产品开发奠定了效用评价基础。