白鲜皮主要药效成分白鲜碱、黄柏酮、梣酮的抗皮炎作用比较及机制研究

杨妞妞，邵海峰，邓嘉林，金 涵，许陆欢，刘延庆

1扬州大学医学院，江苏 扬州 225009；2扬州大学附属医院中医科，江苏 扬州 225012

特应性皮炎（atopicdermatitis，AD）是一种常见的以皮肤屏障功能破坏及持续性瘙痒症状为特征的慢性复发性的炎症性皮肤疾病，影响全球10%～30%的儿童和2%～10%的成人，全球流行率接近2.3亿例，严重影响患者的健康和生活质量，并加重其经济负担［1］。多项研究表明：Th2细胞介导的免疫、皮肤屏障功能障碍和瘙痒是导致AD“抓—痒—抓”恶性循环的重要因素，白介素（interleukin，IL）-31、IL-4、IL-13、IL-5、胸腺基质淋巴细胞生成素（thymic stromal lymphopoietin，TSLP）等细胞因子在AD 引起的皮肤炎症和瘙痒的病理进展过程中发挥重要作用［2］。Janus 激酶（janus kinase，JAK）-信号转导和转录激活因子（signal transducer and activator of transcription，STAT）通路参与了上述多数细胞炎症因子在AD 中的免疫应答，此外，JAK-STAT 还参与调节AD表皮屏障功能及瘙痒信号转导［3-4］。因此JAK信号通路可能是治疗皮炎的重要靶点。

白鲜皮是芸香科植物白鲜的干燥根皮，具有清热祛湿、祛风解毒的作用，在临床上被广泛用于治疗哮喘、风湿、黄疸、冠状动脉粥样硬化以及湿疹、荨麻疹、疥疮等多种疾病［5］。现代药理学研究表明，白鲜皮提取物具有抗炎、抗过敏、抗癌、抗氧化和保肝等作用［6-7］，但关于其止痒作用的实验室研究却很少，尤其是白鲜皮主要活性成分中哪些能够在皮炎治疗中发挥抗炎止痒作用的研究鲜有报道。白鲜皮的主要成分有生物碱类、柠檬苦素类、香豆素类、甾体类及多糖等，其中，白鲜碱、黄柏酮、梣酮是衡量白鲜皮药物质量的3种主要指标性成分［8-9］。白鲜碱具有抗炎、抗过敏、抗癌等作用［10-11］；梣酮具有抗炎、抗癌、抗氧化应激、抗纤维化等作用［12-15］；黄柏酮具有抗氧化、抗炎、抗癌、抗高血糖和抗肥胖作用［16-18］。本研究旨在利用AD 小鼠模型比较白鲜皮3 种指标性活性成分的抗炎止痒作用，并观察其对炎症因子及JAK1-STAT3/STAT6 信号通路的影响，为白鲜皮活性成分在临床的应用提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料

6～8 周龄雄性C57BL/6 小鼠购买于扬州大学比较医学中心，动物饲养于SPF级动物实验房中，温度控制在（22±2）益，12 h 光照/黑暗循环，自由饮食。所有动物的饲养及实验程序均按照扬州大学动物护理与使用委员会制定的指南进行，并获得扬州大学医学院伦理委员会批准（编号：YXYLL-2022-52）。

白鲜皮饮片（生药，批号：211102，苏州市天灵中药饮片有限公司），白鲜碱、梣酮、黄柏酮（成都曼斯特生物科技有限公司），2，4-二硝基氟苯（2，4-dinitrofluorobenzene，DNFB）（上海麦克林生化科技股份有限公司），醋酸地塞米松片（dexamethasone，DEX）（0.75 mg/片，批号：2005002，许昌百正药业股份有限公司）；小鼠IL-4、IL-10、IL-31酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）；兔抗GAPDH多克隆抗体（杭州贤至生物科技公司）；兔单克隆抗体JAK1、p-JAK1、STAT3、p-STAT3、STAT6、p-STAT6和山羊抗兔二抗（Abcam 公司，美国）。真空旋转蒸发仪（上海靳澜制造公司），恒温干燥箱（上海一恒公司），高清摄像机（型号HF10，佳能公司，日本），冰冻切片机（型号CM1950，Thermo 公司，美国），正置光学显微镜（型号BX43，Olympus 公司，日本），多功能酶标仪（型号EnSpire，PerkinElmer公司，美国），垂直电泳仪（型号164-5050）、凝胶成像系统（型号ChemiDoc XRS+）（Bio-Rad公司，美国）。

1.2 方法

1.2.1 白鲜皮乙醇提取物的制备

将1 kg 白鲜皮药材粉碎，加入10 L 的95%乙醇，在热回流提取系统中煮沸提取2 次，每次2 h。然后将提取液混合、过滤并使用真空旋转系统蒸发浓缩，将浓缩液在恒温干燥箱烤箱中干燥烘干，共获得67.5 g 的白鲜皮乙醇提取物，提取率6.75%。利用UPLC对白鲜皮醇提物主要成分进行鉴定和测定。

1.2.2 建立特应性皮炎小鼠模型

在小鼠颈背部反复应用DNFB 诱导AD 小鼠模型，造模方法如图1A 所示。提前5 d 在小鼠腹部剃毛（2 cm×2 cm），暴露腹部皮肤。2 d 后给予腹部剃毛部位20 μL 0.5%DNFB 溶液（溶于4∶1的丙酮、橄榄油混合液），并对小鼠颈背部进行剃毛处理（2 cm×2 cm）。3 d 后给予小鼠颈背部剃毛的区域20 μL 0.2%DNFB 溶液刺激。此后每隔2 d 给予小鼠颈背部同样的刺激进行敏化，持续2周。

1.2.3 动物分组与处理

在白鲜皮醇提物抑制皮炎引起的慢性瘙痒研究中，小鼠随机分为空白对照组、模型组、白鲜皮醇提物组，每组6只。对照组按上述造模方法，采用不含DNFB 的丙酮/橄榄油混悬液进行刺激，不予药物治疗。模型组和白鲜皮醇提物组均按上述方法进行模型制备，模型组采用羧甲基纤维素钠（carboxymethylcellulose sodium，CMC-Na）灌胃治疗，白鲜皮醇提物组给予白鲜皮醇提物（300 mg/kg，溶于0.5%CMC-Na溶液中）灌胃治疗，均每天1次。

在白鲜皮活性成分的抗皮炎作用研究中，小鼠随机分为模型组、白鲜碱组、黄柏酮组、梣酮组、地塞米松组（每组8 只），均采用上述方法进行AD 小鼠模型制备。模型组采用CMC-Na 灌胃治疗，其余组分别给予白鲜碱（10 mg/kg）、黄柏酮（10 mg/kg）、梣酮（10 mg/kg）、地塞米松（1 mg/kg）灌胃治疗，每天1次，持续14 d。

1.2.4 抓痒次数统计

每天早晨固定时间在安静环境下利用高清摄像机进行小鼠抓痒行为学录制，将小鼠后足抬起抓挠颈背部的行为记作1次有效的抓挠。由1名不知晓实验分组的研究者统计每5 min间隔内小鼠抓痒次数，共统计30 min。

1.2.5 皮损评分及体重变化评估

每2 d 对小鼠颈背部的皮肤损害情况进行1 次评分。以小鼠皮肤损害的特征性症状（红斑、水肿、鳞屑/干燥、剥脱/糜烂、出血）为评分的基础，分为0分（无症状）、1分（轻度症状）、2分（中度症状）、3分（重度症状）3 个等级［19］。每2 d 称量1 次小鼠体重，监测造模期间小鼠体重变化。在造模第14 天采用高分辨率照相机拍摄小鼠颈背部皮损照片。

1.2.6 组织病理学分析

小鼠颈背部造模区域皮肤，4%多聚甲醛溶液中固定过夜，蔗糖梯度脱水，包埋后采用莱卡冰冻切片机切片，厚度10 μm。进行苏木素-伊红（hematoxylin-eosin，HE）和甲苯胺蓝染色，观察皮损区域皮肤表皮厚度和肥大细胞数目变化。

1.2.7 ELISA

切取0.5 cm×0.5 cm 大小的皮肤组织，加入PBS缓冲液，充分匀浆离心后获得组织蛋白上清液，使用BCA 蛋白定量试剂盒定量蛋白浓度，采用ELISA试剂盒检测IL-4、IL-31、IL-10水平。在450 nm波长下检测吸光度并计算炎症因子浓度。

1.2.8 蛋白免疫印迹（Western blot）试验

用含有蛋白酶抑制剂/磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液提取造模区域皮肤组织蛋白质，BCA试剂盒测定蛋白浓度。每组加30 μg 蛋白进行SDS-PAGE 电泳和转膜，5%的脱脂奶粉溶液封闭2 h，加入相应的一抗4 益孵育过夜，TBST洗膜3次后，二抗室温孵育2 h。ECL显影并成像，使用Image J软件对所有条带进行灰度值分析。

1.3 统计学方法

使用Prism 8 软件用于所有的数据分析和统计图形绘制，数据以均值±标准差（）表示。采用非配对Student’st检验或单因素方差分析（ANOVA）分析组间差异，使用Dunnett多重比较检验进行事后分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 白鲜皮乙醇提取物对AD小鼠慢性瘙痒的影响

与对照组相比，AD 小鼠抓痒次数不断增加，呈现了强烈的搔抓行为，而给予白鲜皮醇提取物干预，能明显抑制特应性皮炎小鼠的抓痒。在造模第14天，空白对照组、模型组、白鲜皮醇提物组的抓痒次数分别为（34.3±5.7）次、（243.7±47.5）次、（119.3±33.0）次，差异有统计学意义（图1）。

2.2 黄柏酮、白鲜碱、梣酮对AD小鼠引起的慢性瘙痒的影响

造模第14天，白鲜碱组、梣酮组、地塞米松组都明显抑制了AD 小鼠的强烈搔抓，但黄柏酮组的抓痒次数仍维持在较高水平，与模型组相比，差异无统计学意义（图2）。

图2 黄柏酮、白鲜碱、梣酮对AD小鼠慢性瘙痒行为的影响Figure 2 Effects of obacunone，dictamnine，and fraxinellone on chronic itch behavior in AD mice

2.3 黄柏酮、白鲜碱、梣酮对小鼠AD小鼠皮炎症状的影响

造模第14 天，模型组小鼠的平均皮损评分为（2.60±0.24）分，黄柏酮组小鼠的平均皮损评分为（2.71±0.18）分，两组均出现严重的结痂、剥脱、红斑等症状。而白鲜碱组［（1.50±0.16）分］与梣酮组［（1.22±0.22）分］小鼠的皮损评分明显降低，地塞米松组小鼠的皮损评分［（1.62±0.26）分］也有一定程度的改善（图3A～C）。此外，模型组、黄柏酮组、地塞米松组小鼠体重增幅略小于白鲜碱和梣酮组（图3D～E）。

图3 黄柏酮、白鲜碱、梣酮对AD小鼠皮炎症状及体重变化的影响Figure 3 Effects of obacunone，dictamnine，and fraxinellone on dermatitis symptoms and body weight changes in AD mice

2.4 黄柏酮、白鲜碱、梣酮对AD小鼠组织病理学变化的影响

造模第14天，模型组小鼠的表皮厚度显著增加［（105.30±1.96）μm］。与模型组相比，黄柏酮组小鼠的表皮厚度差异无统计学意义［（98.67±5.52）μm］，而白鲜碱组小鼠的表皮厚度减少至（42.75±1.30）μm（P＜0.001，n=4），梣酮组小鼠的表皮厚度减少至（68.81±1.67）μm（P＜0.001，n=4）。地塞米松也抑制了AD小鼠的表皮增厚（图4A、C）。

图4 黄柏酮、白鲜碱、梣酮对AD小鼠皮损区域组织病理学变化的影响Figure 4 Effecsof obacunone，dictamnine，and fraxinellone on histopathological changes in the lesional skin of AD mice

甲苯胺蓝染色结果显示：模型组小鼠的皮肤组织中肥大细胞数量显著增加，而在白鲜碱和梣酮组中肥大细胞数量明显被抑制（图4B、D）。这些结果与之前的行为学和皮损评分一致。

2.5 黄柏酮、白鲜碱、梣酮对AD小鼠皮损区域炎症细胞因子表达的影响

与模型组相比，白鲜碱和梣酮治疗显著下调了炎症因子IL-4、IL-31水平，上调了抑炎因子IL-10的水平，而黄柏酮组与模型组比较无统计学差异（图5）。

图5 黄柏酮、白鲜碱、梣酮对AD小鼠皮损区域皮肤炎症细胞因子表达的影响Figure 5 Effects of obacunone，dictamnine，and fraxinellone on the expression of inflammatory cytokines in the lesional skin of AD mice

2.6 黄柏酮、白鲜碱、梣酮对AD 小鼠皮肤组织中JAK1-STAT3/STAT6信号通路的影响

与模型组相比，白鲜碱和梣酮显著抑制了小鼠皮肤组织中JAK1、STAT3、STAT6 的总蛋白和磷酸化蛋白水平，差异有统计学意义。黄柏酮组的JAK1、STAT3、STAT6的磷酸化蛋白水平与模型组差异无统计学意义（图6）。

图6 黄柏酮、白鲜碱、梣酮对AD小鼠皮损区域皮肤JAK1、STAT3、STAT6蛋白及磷酸化蛋白水平的影响Figure 6 Effects of obacunone，dictamnine，and fraxinellone on the levels of JAK1，STAT3，STAT6 proteins and phosphorylated proteins in the lesional skin of AD mice

3 讨论

瘙痒和炎症浸润的皮肤损伤是皮炎的主要症状，恶性的“瘙痒-抓挠”循环是AD发病机制中的关键因素之一。反复地抓挠可以激活上皮细胞、免疫细胞、神经元等促进或加重瘙痒及炎症的发生，甚至导致睡眠障碍，诱发焦虑、抑郁等负面情绪［20-21］。在DNFB诱导的AD小鼠模型中，小鼠呈现了强烈的搔抓行为，但在给予白鲜皮醇提物治疗后明显被抑制。以往对白鲜皮的研究多集中在抗炎作用的探讨［22-23］，本研究首次明确了白鲜皮对皮炎引起的慢性瘙痒的抑制作用。在对白鲜皮的主要指标药效成分——黄柏酮、白鲜碱、梣酮的研究中，本研究发现，对AD小鼠诱导的慢性瘙痒行为，白鲜碱和梣酮都呈现了明显的抑制作用，而黄柏酮组小鼠抓痒次数仍维持在较高水平。在对白鲜碱组和梣酮组的抓痒次数进行比较后发现，两组差异无统计学意义，这提示白鲜碱和梣酮可能都是白鲜皮发挥止痒作用的重要成分。

在DNFB 构建的AD 小鼠模型中，随时间进程，频繁地抓挠会破坏皮肤屏障，导致表皮增厚，刺激炎症因子释放，加重“抓-痒-抓”恶性循环，小鼠造模区域会出现明显的干燥、红肿、渗出、结痂等炎症表现［24］。在给予白鲜碱和梣酮治疗后，小鼠皮损评分明显减低，皮肤炎症症状明显改善。HE 和TB 染色结果显示，白鲜碱和梣酮治疗显著抑制了AD 小鼠的表皮增厚及增多的肥大细胞数目。这表明白鲜碱和梣酮对AD小鼠具有一定的皮肤屏障保护作用。黄柏酮组的肥大细胞数目虽然也有减少，但黄柏酮组在皮损评分、表皮厚度的检测中与模型组没有统计学差异，推测黄柏酮可能在一些炎症免疫应答中也发挥作用，但它在抑制AD 小鼠瘙痒中效果并不理想。另外，频繁地抓挠可能会抑制小鼠食欲，影响小鼠的体重。通过对小鼠体重进行监测发现，白鲜碱和梣酮组小鼠体重增幅要略高于DNFB模型组，提示白鲜碱和梣酮可能具有较小的不良反应。

多项研究表明，AD 引发的皮肤炎症和皮肤屏障破坏主要由T 细胞介导［21，25］。Th2 型细胞因子如IL-4、IL-31 可以激活JAK1-STAT3/STAT6 信号通路参与表皮屏障、皮肤通透性和皮肤固有免疫缺陷反应。在AD患者病变皮肤和血清中，IL-4、IL-31表达明显上调，在AD 炎症和瘙痒中都发挥重要作用。IL-10 作为抗炎因子，抑制IL-10 会加剧Th2 介导的皮炎并引发慢性炎症［26-27］。本研究结果表明：白鲜碱和梣酮治疗能够显著抑制AD小鼠病变皮肤中IL-4、IL-31 的水平，增强抗炎因子IL-10 的表达。黄柏酮组对IL-4、IL-31、IL-10 的影响与AD 小鼠模型组并没有明显差异。白鲜碱和梣酮还能明显抑制JAK1-STAT3/STAT6 信号通路的磷酸化激活，抑制炎症信号转导。但是白鲜碱和梣酮对JAK1、STAT3、STAT6 的总蛋白水平也有影响，本研究推测，这可能是因为白鲜碱和梣酮对AD的治疗作用不是直接作用于JAK1-STAT3/STAT6信号通路，而是作用于其上游靶点，从而影响JAK1、STAT3、STAT6 总蛋白水平和相应蛋白磷酸化水平的变化。虽然黄柏酮也能够降低JAK1 和STAT3 的总蛋白水平，但对JAK1和STA3/STAT6的磷酸化蛋白水平并没有明显作用，这与之前的实验结果一致，进一步证明了黄柏酮对AD引起的炎症和瘙痒无明显抑制作用。

本研究首次明确了白鲜皮对AD小鼠的慢性瘙痒的抑制作用。它的3 个指标性药效成分中，白鲜碱和梣酮能明显抑制AD 小鼠诱导的抓挠行为，改善皮损症状，抑制表皮增厚和肥大细胞数目增多，通过调控JAK1-STAT3/STAT6 通路发挥抗皮炎作用，而黄柏酮则无类似作用。虽然白鲜碱和梣酮在AD 中的作用机制还有待进一步探索，但本研究结果表明，白鲜碱和梣酮在抗炎止痒的新药开发领域具有十分广阔的研究前景。