天麻活性成分减轻大鼠神经元氧糖剥夺/复糖复氧损伤的作用机制Δ

王 锦，夏霜莉，杨 媛，代 蓉#（.云南中医药大学中药学院，昆明 650500；.昆明医科大学第一附属医院临床药学中心，昆明 65003）

神经血管单元（neurovascular unit，NVU）主要包括神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞、脑微血管内皮细胞（brain microvascular endothelial cells，BMECs）、细胞外基质等，各组成间相互协调，共同维持脑组织内环境的整体稳态。脑缺血再灌注损伤（cerebral ischemic reperfusion injury，CIRI）发生后，BMECs、胶质细胞被激活，血脑屏障通透性发生改变，神经元受损凋亡，导致NVU的稳态失衡，从而影响神经系统功能[1―2]。相关研究发现，在NVU微环境中，BMECs不仅可为神经元提供突触间信号传递时所需要的能量，还可在CIRI情况下通过释放脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）调控神经元活性，发挥神经保护作用[3―4]。因此，通过药物干预加强BMECs 与神经元之间的信号联系以促进机体自身的内源性修复，对CIRI的治疗具有重要的意义。

本课题组前期研究表明，天麻主要活性成分3，4-二羟基苯甲醛（3，4-dihydroxybenzaldehyde，3，4-DD）具有减轻大脑中动脉闭塞再灌注（middle cerebral artery occlusion/reperfusion，MCAO/R）模型大鼠脑损伤，保护受损神经元的作用[5―7]，但作用机制尚不明确。目前常以神经元和BMECs 共培养模拟NVU[8]，但是由于原代神经元生长周期长，无法进行传代，故常用中分化型的大鼠肾上腺嗜铬细胞PC12 代替神经元进行研究[9]。基于此，本研究采用Transwell小室建立BMECs-PC12共培养氧糖剥夺/复糖复氧（oxygen and glucose deprivation/reperfusion，OGD/R）损伤模型，探讨3，4-DD 对CIRI 的改善作用及机制，以期为CIRI的治疗药物开发提供参考。

1 材料

1.1 主要仪器

3111 型CO2细胞培养箱、QuantStudio 5 型实时荧光定量聚合酶链式反应（PCR）仪购自美国Thermo Fisher Scientific 公司；Ti-S 型倒置相差显微镜购自日本Nikon公司；Infinite M200 PRO型酶标仪购自瑞士Tecan公司；ERS-2型细胞电阻仪、Transwell小室（孔径0.4 μm，有效膜面积0.33 cm2）购自美国Millipore公司。

1.2 主要药品与试剂

3，4-DD（批号256775）购于北京百灵威科技有限公司；丁苯酞（NBP，批号118170230）购于石药集团恩必普药业有限公司；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（批号AGH1533A）购自日本Takara公司；0.25%胰蛋白酶、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）（批号分别为03-050-1A、04-01-1A）购自以色列Biological Industries公司；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）（批号033100g）购自美国Amresco 公司；DMEM/F12 培养基、DMEM/RPMI 1640 培养基（批号分别为CLL330500B、58903）购自美国Gibco公司；兔抗Ⅷ因子单克隆抗体（批号NB10091761Cy）购自美国Novus Biologicals 公司；山羊抗兔荧光单克隆抗体（二抗，批号C2306）购自美国Sigma公司；乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）测试盒（批号QS1001）购自南京建成生物工程研究所；BDNF 酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒（批号K2401874）购自武汉华美生物工程有限公司。酪氨酸激酶受体B（tyrosine kinase receptor B，TrkB）、磷脂酶c-γ（phospholipase c-γ，Plc-γ）、微管蛋白2（microtubule associated protein-2，Map-2）、神经调节素43（growth associated protein-43，GAP-43）的引物由昆明硕擎生物技术有限公司合成，具体信息见表1。

1.3 细胞

大鼠肾上腺嗜铬细胞PC12购自北京北纳创联生物技术研究院，将其以DMEM/RPMI 1640 培养基（含10% FBS，40 U/mL 青链霉素双抗）于37 ℃、5% CO2及饱和湿度的培养箱中进行培养。

1.4 动物

本研究所用动物为SPF 级SD 大鼠，体重250～300 g，购自辽宁长生生物技术股份有限公司，动物生产许可证号为SCXK（辽）2015-0001。取成年雌鼠1 只、雄鼠2只进行合笼饲养，于第2天观察鼠笼底层是否有阴栓，于见到阴栓之日将雌鼠与雄鼠分开饲养，等待雌鼠生产。饲养环境温度22～24 ℃，湿度50%～60%，12 h 明暗交替。动物实验均经云南中医药大学动物保护委员会批准（批准号为R-06202003）。

2 方法

2.1 原代BMECs分离、培养和鉴定

取出生7 d 的乳鼠大脑皮质，用无菌组织剪将皮层组织剪碎，1 000 r/min 离心3 min；弃除上清液后按1∶1的体积比加入BSA 溶液，并充分吹打混匀，2 500 r/min离心8 min；弃去上清液，收集管底微血管段沉淀，然后接种于DMEM/F12 培养基（含20% FBS、40 U/mL 青链霉素双抗）的明胶包被培养瓶中，于37 ℃细胞培养箱中进行培养；24 h 后更换新鲜培养液，细胞生长状态稳定后每2 d换液1次。待细胞生长密度达90%，进行传代纯化，取传至第3代的细胞用于实验。取部分BMECs以Ⅷ因子抗体染色后在荧光显微镜下观察，当出现Ⅷ因子阳性表达（呈红色）时，则表明原代BMECs培养成功。

2.2 BMECs-PC12 共培养体系构建和OGD/R 损伤模型的建立

分别取PC12 细胞和BMECs，以磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤2 次，加入0.25%胰酶置于37 ℃培养箱中消化5 min；当80%细胞收缩变圆并漂浮时，向PC12 细胞中立即加入含10% FBS 的DMEM/RPMI 1640 培养基终止消化，向BMECs 中加入含20% FBS 的DMEM/F12 培养基终止消化；将两种细胞以1 000 r/min离心5 min，收集管底细胞沉淀，加入培养基重悬，调整PC12 细胞、BMECs 的密度分别至1.0×106、4.0×105个/mL。将PC12 细胞接种于6 孔板中，待其生长1 d 后用于共培养实验。将BMECs接种于已提前包被好明胶的Transwell小室内侧，将插入室放入已接种PC12细胞的6孔板中共培养2 d。当两种细胞生长密度达90%时，检测BMECs-PC12 共培养体系的跨膜电阻（transendothelial electronic resistance，TEER）、PC12 细胞中LDH 活性；当BMECs-PC12 共培养体系的TEER 和其中PC12 细胞中LDH 活性相较于两种细胞单独培养显著升高时，则表明BMECs-PC12共培养体系构建成功[10]。

将上述BMECs-PC12共培养体系取出，弃掉原培养基，以PBS清洗细胞后，换入无糖无血清培养基，置于含1% O2的37 ℃恒温恒湿培养箱中进行氧糖剥夺；8 h后取出，弃去无糖无血清培养基，换入新鲜的完全培养基，置于含5% CO2的37 ℃恒温恒湿培养箱中进行复糖复氧10 h；复糖复氧结束后，检测BMECs-PC12共培养体系4 h渗漏液面差、TEER、PC12 细胞中LDH 活性，当4 h 渗漏液面差增大，TEER、PC12细胞中LDH活性降低时，表明BMECs-PC12共培养OGD/R损伤模型构建成功[10]。

2.3 分组与给药

将BMECs-PC12 共培养体系分为对照组、模型组、NBP 组（阳性对照组，0.1 mmol/L，浓度参考文献[11]设置）、3，4-DD组（0.1 μmol/L，浓度依据前期研究[7]设置），每组均设置4个复孔。NBP组和3，4-DD组给予相应药物干预Transwell 小室内侧BMECs 24 h，对照组和模型组以等量培养基代替，然后除对照组外，其余各组均按“2.2”项下方法复制BMECs-PC12 共培养OGD/R 损伤模型。

2.4 BMECs-PC12 共培养体系的TEER 和PC12 细胞中LDH活性的检测

氧糖剥夺8 h/复糖复氧10 h 后，采用ERS-2 型电阻仪检测BMECs-PC12 共培养体系的TEER，取平均值。上述检测结束后，取体系中部分PC12细胞进行裂解，然后离心取上清液，按试剂盒说明书方法操作，测定PC12细胞中LDH活性。

2.5 PC12细胞中BDNF水平的检测

“2.4”项下实验结束后，取板底PC12细胞的培养液，然后按ELISA 试剂盒说明书方法操作，检测PC12 细胞中BDNF水平。

2.6 PC12 细胞中TrkB、Plc-γ、Map-2、GAP-43 mRNA表达水平的检测

采用荧光定量PCR 法进行检测。“2.4”项下实验结束后，取部分PC12细胞进行裂解，然后用相应试剂盒提取总RNA，逆转录合成cDNA，再以cDNA 进行PCR，反应条件为：50 ℃预处理2 min；95 ℃预变性2 min；95 ℃变性15 s，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸7 min，循环40次。以GAPDH为内参，采用2-ΔΔCt法检测PC12细胞中TrkB、Plc-γ、Map-2、GAP-43 mRNA的表达水平。

2.7 统计学方法

采用GraphPad Prism 8.0.1 软件进行统计学分析。数据以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析；符合正态分布且方差齐时，组间两两比较采用Dunnett’st检验；不符合正态分布时，采用秩和检验。检验水准α＝0.05。

3 结果

3.1 原代BMECs的分离鉴定结果

结果显示，显微镜下Ⅷ因子呈红色，原代BMECs培养成功。结果见图1。

图1 原代BMECs的分离鉴定结果

3.2 3，4-DD 对共培养体系OGD/R 损伤模型的TEER以及PC12细胞中LDH活性及BDNF水平的影响

与对照组比较，模型组BMECs-PC12共培养体系的TEER 以及PC12 细胞中LDH 活性和BDNF 水平均显著降低（P＜0.01）；与模型组比较，NBP 组、3，4-DD 组BMECs-PC12 共培养体系中上述指标均显著逆转（P＜0.05或P＜0.01）。结果见表2。

表2 各组共培养体系的TEER以及PC12细胞中LDH活性和BDNF水平的检测结果（±s，n＝4）

表2 各组共培养体系的TEER以及PC12细胞中LDH活性和BDNF水平的检测结果（±s，n＝4）

a：与对照组比较，P＜0.01；b：与模型组比较，P＜0.05；c：与模型组比较，P＜0.01。

组别对照组模型组NBP组3，4-DD组TEER/（Ω·cm2）364.8±29.68 235.3±26.27a 289.3±11.44b 349.8±18.79c LDH活性/（U/g）3.00±0.30 2.20±0.22a 2.73±0.17b 3.18±0.22c BDNF水平/（ng/L）4.29±0.43 2.52±0.47a 4.38±0.49c 3.97±0.55c

3.3 3，4-DD对共培养体系OGD/R损伤模型PC12细胞中TrkB、Plc-γ、Map-2、GAP-43 mRNA表达的影响

与对照组比较，模型组PC12 细胞中TrkB、Plc-γ、Map-2、GAP-43 mRNA表达水平均显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，NBP 组、3，4-DD 组PC12 细胞中上述指标表达水平均进一步显著升高（P＜0.05 或P＜0.01）。结果见表3。

表3 PC12细胞中TrkB、Plc-γ、Map-2、GAP-43 mRNA表达水平的检测结果（±s，n＝4）

表3 PC12细胞中TrkB、Plc-γ、Map-2、GAP-43 mRNA表达水平的检测结果（±s，n＝4）

a：与对照组比较，P＜0.01；b：与模型组比较，P＜0.01；c：与模型组比较，P＜0.05。

组别对照组模型组NBP组3，4-DD组TrkB mRNA 1.00±0.00 8.18±1.23a 13.63±1.60b 11.55±1.85c Plc-γ mRNA 1.00±0.00 8.16±1.21a 14.73±0.88b 12.61±2.17b Map-2 mRNA 1.00±0.00 8.83±0.28a 12.38±1.23b 10.35±0.82c GAP-43 mRNA 1.00±0.00 21.19±1.29a 26.83±1.45b 26.05±1.68b

4 讨论

CIRI的发生是由NVU中多种细胞相互作用导致的级联反应，可引起神经炎症的发生、BMECs间紧密连接破坏、脑微环境稳态失调、神经功能受损。BMECs是血脑屏障的结构基础，其产生的BDNF 可作用于轴突，为神经元提供营养[12]。TEER是评价紧密连接功能和血脑屏障细胞旁转运的方法[13]；LDH 存在于所有细胞中，当细胞膜损伤时可快速释放至细胞培养液中，因此常作为衡量细胞是否完整的重要指标[14]。本研究结果显示，BMECs-PC12 共培养体系经OGD/R 后，TEER、PC12 细胞中LDH活性和BDNF水平均降低，提示BMECs-PC12共培养体系的屏障功能被破坏，PC12细胞受损；经3，4-DD干预后，共培养体系的TEER以及PC12细胞中LDH活性和BDNF水平均升高，表明3，4-DD可减轻BMECs-PC12 共培养体系的OGD/R 损伤，并促进BMECs、PC12细胞生成并释放BDNF。

BMECs的旁分泌功能可通过调控BDNF/TrkB信号通路，增加神经元细胞膜上Plc-γ、Map-2、GAP-43 蛋白的表达，其中Plc-γ 可介导蛋白激酶C 调节突触可塑性[15]；Map-2是组成神经元细胞骨架的重要组成部分，其表达水平能反映神经元树突的破坏情况[16]；GAP-43可参与神经细胞外生长及突触发育形成和神经细胞再生，能调节轴突的延伸作用，增强与G蛋白偶联的受体的转运作用[17]。促进Plc-γ、Map-2、GAP-43 的表达可维持神经元轴突和树突的生长，恢复神经元间信号的传导，减轻神经元的损伤[18]。本研究结果显示，BMECs-PC12 共培养体系经OGD/R 后，PC12 细胞中TrkB、Plc-γ、Map-2、GAP-43 mRNA 表达水平升高，提示共培养体系在受到OGD/R 刺激后，细胞自身触发内源性修复作用；经3，4-DD干预后，PC12细胞中上述指标表达水平均进一步升高，提示3，4-DD 可通过作用于Transwell 小室上层BMECs，促进BDNF 分泌，启动BDNF/TrkB 信号通路，调节PC12的突触可塑性，增强BMECs与神经元之间的信号联系以促进内源性修复，进而保护神经元。

综上所述，3，4-DD 可通过作用于BMECs 减轻神经元OGD/R 损伤，其作用机制可能与激活BDNF/TrkB 信号通路有关。由于本实验无法充分反映细胞间和细胞外基质的相互作用，后续还需要观察多个细胞之间的相互作用，进一步探讨3，4-DD保护神经元的作用机制。