PAD4介导的H3cit在脓毒症相关急性肾损伤中的作用机制研究

韦泽丰, 王自强, 郑金花, 张瑞城

作者单位：570102 海口,海南医学院第一附属医院肾内科

脓毒症是由病毒、真菌或细菌感染引起的全身炎症反应,可引起炎症细胞因子的过度释放,造成组织损伤和多器官功能障碍,最终导致患者死亡[1]。因此,需要及时采取相关措施预防和治疗脓毒症。急性肾损伤(acute kidney injury,AKI)是脓毒症的主要并发症,其特征是肾功能急剧下降,增加患者的死亡风险[2-3]。然而,关于脓毒症引起AKI的机制有待进一步研究。肽基精氨酸脱亚胺酶(peptidylarginine deiminase,PAD)可以将组蛋白及其他蛋白的精氨酸残基以脱亚胺的方式水解为瓜氨酸[4]。PAD4是PAD的一种亚型,位于细胞核和细胞质中,在中性粒细胞中高表达[5]。PAD4可催化瓜氨酸化组蛋白H3(citrullinated histone H3,H3cit)形成,后者可导致染色质去浓缩,进一步形成中性粒细胞胞外诱捕网(neutrophil extracellular traps,NETs)的主要调节因子[6]。有研究表明,过度的NETs释放会加重内毒素休克与脓毒血症[7]。此外,PAD4介导的肽基瓜氨酸化蛋白在多种自身免疫性疾病和缺血性疾病中呈高表达,如多发性硬化症等[8]。使用PAD4的抑制剂BB-Cl-amidine抑制PAD4酶活性可减轻炎症细胞因子浸润、纤维蛋白沉积和血栓的形成[9]。PAD4介导的H3cit通过加剧肾脏缺血和再灌注后的炎症反应导致急性组织损伤[10],但其对脓毒症相关AKI的影响及机制尚缺乏相关研究。脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是存在于革兰阴性菌表面的内毒素,已被广泛用于制备实验性脓毒症相关AKI的模型[11]。本研究通过腹腔注射LPS构建脓毒症相关AKI小鼠模型,通过口服灌胃BB-Cl-amidine抑制PAD4酶活性,检测H3cit水平、肾脏病理情况、肾损伤及肾脏氧化应激水平,评估PAD4介导的H3cit在脓毒症相关AKI进程中的作用,为脓毒症相关AKI的预防及治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1实验动物 选择无特定病原体(specific pathogen free,SPF)级雄性C57BL/6J小鼠30只(6～8周龄,20～25 g),购自海南药物研究所有限责任公司,使用许可证号为SCXK(琼)2020-0007。所有小鼠饲养环境温度25 ℃,自然光暗周期,实验期间自由饮食。

1.2细胞和主要试剂 肾上皮细胞HEK293T购自北京安必奇生物科技有限公司。BB-Cl-amidine购自MedChemExpress公司。LPS购自北京百奥莱博科技有限公司。RIPA裂解液、BCA蛋白检测试剂盒、蛋白上样缓冲液购自上海碧云天生物技术有限公司。胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)购自美国ThermoFisher。CCK-8试剂盒购自武汉菲恩生物科技有限公司。PAD4、H3cit和GAPDH抗体购自美国Abcam。辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG购自武汉三鹰生物技术有限公司。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、血清肌酐(serum creatinine,SCr)、尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)、尿微量白蛋白(urinary microalbumin,UALb)、肌酐(creatinine,Cr)比色法测试盒购自南京建成生物工程研究所。H3cit的酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测试剂盒购自江苏雨桐生物科技有限公司。苏木精-伊红(hematoxylin and eosin,HE)染色液购自云科生物技术有限公司。

1.3实验方法

1.3.1 动物造模与干预方法 将30只C57BL/6J小鼠随机分为对照组、模型组和给药组,每组10只。给药组连续7 d灌胃BB-Cl-amidine(按体重1 μg/g给药[12]),其余两组灌胃同体积生理盐水。7 d后对模型组和给药组小鼠腹腔注射LPS(10 mg/kg),对照组注射同体积生理盐水,24 h后收集眼球外周血,并脱颈椎处死小鼠。

1.3.2 细胞培养与干预方法 使用添加了10% FBS以及100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素的DMEM培养基培养HEK293T细胞,培养箱环境条件设置为95%空气、5% CO2、37 ℃。及时更换培养基以满足细胞生长需要,待细胞生长密度到达80%时进行消化传代。将细胞分为空白组、LPS组、LPS+BB-Cl-amidine组。LPS+BB-Cl-amidine组需提前加入10 μM浓度BB-Cl-amidine预处理24 h,LPS组和LPS+BB-Cl-amidine组加入50 μg/ml LPS刺激24 h,收集细胞进行下一步检测。

1.3.3 Western blot法检测PAD4和H3cit蛋白表达水平 收集小鼠肾皮质组织和处理后的HEK293T细胞,然后分别加入RIPA裂解液,并在冰上孵育60 min。在4 ℃下以12 000 r/min离心5 min。按照BCA检测试剂盒说明书进行蛋白含量检测。经加温处理后将蛋白样本与蛋白上样缓冲液进行混合,使用12%聚丙烯酰胺凝胶进行SDS-PAGE电泳实验。通过湿转法将蛋白质转移到PVDF膜上,使用含5%脱脂奶粉的TBST溶液在室温下封闭处理1 h,PAD4、H3cit和GAPDH一抗(1∶1 000稀释)4 ℃孵育过夜。以TBST溶液洗膜3次,10 min/次,二抗使用辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(1∶5 000稀释)室温孵育1 h。加入TBST溶液洗膜3次,10 min/次。加入显色液,应用Tanon5200化学发光成像仪拍摄,通过Image J软件进行灰度值分析,以GAPDH为内参计算目标蛋白的相对表达量。实验设置3个复孔。

1.3.4 ELISA法检测血清H3cit水平 将外周血以4 000 g、4 ℃条件离心5 min后收集血清。按照H3cit的ELISA检测试剂盒说明书操作方法测定血清H3cit水平。实验设置10个复孔。

1.3.5 肾功能指标测定 将外周血以4 000 g、4 ℃条件离心5 min后收集血清。按照ELISA检测试剂盒说明书操作方法测定血清SCr、BUN水平。使用小鼠代谢笼留取小鼠处死前24 h的尿液,测定尿液UALb、Cr水平,结果以UALb/Cr比值呈现,实验操作方法严格按照试剂盒说明书进行。实验设置10个复孔。

1.3.6 HE染色方法 收集小鼠肾脏组织,4%多聚甲醛固定过夜,然后予10% EDTA脱钙,石蜡包埋后切片,切片厚度约为5 μm。使用梯度浓度乙醇对切片进行脱蜡和再水化,然后将切片浸入苏木精染色液中,染色5～10 min。使用蒸馏水冲洗切片,直到洗出液呈蓝色。随后,将切片浸入伊红染色液中,染色1～2 min。使用蒸馏水简短冲洗。切片经乙醇脱水,再经二甲苯透化10 min。将已透明的切片滴上树胶,盖上盖玻片封固,显微镜下观察肾脏病理结构。

1.3.7 肾脏皮质组织MDA、SOD水平测定 收集小鼠肾皮质组织,并迅速置于冰冻离心管中,在冰上使用RIPA裂解液裂解60 min。在4 ℃下以12 000 r/min离心5 min,收集上清液,即肾组织均浆。按照SOD和MDA比色法测试盒说明书进行实验操作和测定。实验设置10个复孔。

1.3.8 CCK-8法检测细胞增殖水平 将10 μM浓度BB-Cl-amidine预处理24 h的HEK293T细胞按1×104cells/孔接种于96孔培养板,培养过夜,然后加入50 μg/ml LPS分别刺激0 h、24 h、48 h。设置空白孔(不含细胞),每孔加入10 μl CCK-8溶液,37 ℃培养4 h。通过酶标仪测量450 nm处的光密度值(OD值)。相对增殖水平(%)=(实验组OD值-空白孔OD值)/(0 h实验组OD值-空白孔OD值)×100%。实验设置6个复孔。

2 结果

2.1三组小鼠肾组织PAD4和H3cit表达水平比较 Western blot实验结果显示,与对照组比较,模型组小鼠肾组织PAD4、H3cit蛋白表达显著升高(P<0.05);与模型组比较,给药组小鼠肾组织H3cit蛋白表达水平显著降低(P<0.05),两组PAD4蛋白表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。见图1。

ⓐWestern blot实验结果图。ⓑ三组PAD4蛋白表达水平比较(F=126.343,P<0.001)。ⓒ三组H3cit蛋白表达水平比较(F=135.653,P<0.001)。与对照组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05

2.2三组小鼠血清H3cit、SCr、BUN和尿UALb/Cr比值水平比较 与对照组比较,模型组小鼠血清H3cit、SCr、BUN和尿UALb/Cr比值水平显著升高(P<0.05)。与模型组比较,给药组小鼠血清H3cit、SCr、BUN水平和尿UALb/Cr比值水平显著降低(P<0.05)。Pearson相关性分析结果显示,血清H3cit水平与SCr、BUN、UALb/Cr比值水平呈正相关(P<0.05)。见图2,3。

ⓐ三组血清H3cit水平比较(F=102.734,P<0.001)。ⓑ三组血清SCr水平比较(F=115.574,P<0.001)。ⓒ三组血清BUN水平比较(F=138.365,P<0.001)。ⓓ三组尿UALb/Cr比值水平比较(F=157.654,P<0.001)。与对照组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05

图3 三组小鼠血清H3cit水平与SCr、BUN和UALb/Cr比值水平的相关性分析结果图

2.3三组小鼠肾组织HE染色结果 HE染色结果显示,对照组小鼠肾小球完整、无损伤,无炎性细胞浸润。模型组小鼠出现明显的肾小管和间质急性损伤,以及大量的炎性细胞浸润。给药组小鼠的肾小管和间质损伤程度较模型组降低,炎性细胞浸润减少,总体肾损伤程度降低。见图4。

黑色箭头所指为炎性细胞浸润

2.4三组小鼠肾组织MDA、SOD水平比较 与对照组比较,模型组小鼠肾组织MDA水平显著升高、SOD水平显著降低(P<0.05)。与模型组比较,给药组小鼠肾组织MDA水平显著降低,SOD水平显著升高(P<0.05)。见图5。

ⓐ三组MDA水平比较(F=153.653,P<0.001)。ⓑ三组SOD水平比较(F=168.311,P<0.001)。与对照组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05

2.5三组细胞增殖水平及PAD4、H3cit蛋白表达水平比较 CCK-8实验结果显示,与空白组比较,LPS组细胞增殖水平降低,在48 h时有显著性差异(P<0.05);与LPS组比较,LPS+BB-Cl-amidine组细胞增殖水平升高,在48 h时有显著性差异(P<0.05)。见图6。Western blot实验结果显示,与空白组比较,LPS组细胞PAD4和H3cit蛋白表达显著升高(P<0.05);与LPS组比较,LPS+BB-Cl-amidine组细胞H3cit蛋白表达显著降低(P<0.05),但组间PAD4蛋白表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。见图7。

48 h时间点三组相对增殖率比较差异有统计学意义(F=84.323,P=0.003);与空白组比较,*P<0.05;与LPS组比较,#P<0.05

ⓐWestern blot实验结果图。ⓑ三组PAD4蛋白表达水平比较(F=142.663,P<0.001)。ⓒ三组H3cit蛋白表达水平比较(F=184.753,P<0.001)。与空白组比较,*P<0.05;与LPS组比较,#P<0.05

3 讨论

3.1脓毒症是一种危及患者生命的器官功能障碍综合征,其发病率在全球范围内呈持续升高的趋势,住院死亡率为17%～26%[13]。脓毒症常伴有肾脏、肝脏、肺脏、心血管系统和中枢神经系统等功能障碍[14]。在脓毒症患者中AKI的发生率为22%～51%,且与其他器官衰竭及整体不良预后密切相关。AKI患者罹患慢性肾病和终末期肾病的风险更高[15]。脓毒症引起AKI的病理生理机制复杂,预防和治疗AKI的新疗法尚有待进一步开发。

3.2蛋白质的瓜氨酸化是指肽基精氨酸残基通过催化酶转化为瓜氨酸的过程[16]。由于该过程伴随着氨基的去除,因此也称为肽基精氨酸脱氨基反应。这种化学反应伴随着静电荷的变化,会影响蛋白质的折叠状态和功能[17]。PAD是催化蛋白质的精氨酸残基转化为瓜氨酸的脒基转移酶超家族。人类PAD家族包含5个成员:PAD1、PAD2、PAD3、PAD4和PAD6。瓜氨酸化后的蛋白质正电荷减弱,可以通过改变底物结合亲和力而改变蛋白之间相互作用,从而影响蛋白质的功能[18]。PAD4是PAD家族中唯一携带核定位信号序列的成员,能够转移到细胞核并催化形成H3cit。有研究表明,H3cit是一种常见的炎症疾病标志物,细胞外H3cit表现出高毒性,可引起组织损伤,导致多器官衰竭并增加患者死亡风险[19]。Zhang等[20]在三硝基苯磺酸(trinitro-benzene-sulfonic acid,TNBS)诱导的结肠炎小鼠中发现了H3cit和PAD4的表达上调,通过BB-Cl-amidine治疗有效减轻了模型小鼠的临床结肠炎指数和组织炎症水平。Tian等[21]的研究发现,H3cit在感染性休克患者中水平升高,并与疾病的严重程度和预后具有关联。BB-Cl-amidine通过共价修饰PAD4的半胱氨酸活性位点,不可逆地抑制PAD4的酶活性。有研究显示,BB-Cl-amidine治疗可以显著缓解盲肠结扎和穿刺(cecal ligation and puncture,CLP)脓毒症小鼠模型血清中的瓜氨酸化水平,降低促炎细胞因子释放,显著提高了CLP后的存活率[22]。

3.3AKI主要表现为肾功能的突发性破坏和持续性下降,伴随血清BUN、SCr水平显著升高[23]。有研究证实,UALb/Cr比值水平可准确反映肾小球损伤情况,且在临床已广泛应用[24]。在本研究中,通过腹腔注射LPS可以增加血清中SCr、BUN水平与尿UALb/Cr比值水平,表明该剂量的LPS可以成功诱导脓毒症小鼠AKI。据报道,肾小管中PAD4可以加重肾缺血和再灌注损伤后的肾脏炎症反应,这可能与瓜氨酸化蛋白的过度释放进而激活促炎性核因子-κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)信号转导通路有关[25]。本研究结果显示,经LPS干预后,小鼠肾脏及肾上皮细胞HEK293T中PAD4、H3cit水平显著增高,当给予BB-Cl-amidine干预抑制PAD4蛋白活性后,H3cit蛋白水平均显著降低,小鼠肾脏病理情况得到改善,血清中SCr、BUN水平及尿UALb/Cr比值水平降低。表明PAD4介导的H3cit形成可能参与了脓毒症小鼠AKI的进展,抑制PAD4蛋白活性,有助于该疾病治疗。

3.4MDA和SOD可以反映机体的抗氧化能力[26]。据报道,在LPS诱导的急性肺损伤中,PAD4通过促进促炎细胞因子释放和增加机体氧化应激水平的方式,加重了肺水肿及肺损伤[27]。在本研究中,经腹腔注射LPS后,小鼠肾组织中MDA水平升高、SOD水平降低,表明肾脏氧化应激水平增加,抗氧化能力受损,给予BB-Cl-amidine处理抑制PAD4蛋白活性后,SOD水平得到恢复并抑制MDA产生,表明抑制PAD4有助于恢复机体的抗氧化能力。另外,本实验发现经BB-Cl-amidine干预后,细胞增殖水平升高,提示抑制PAD4蛋白活性有助于组织修复。

综上所述,脓毒症相关AKI小鼠肾脏的PAD4、H3cit蛋白水平显著增加,PAD4蛋白可能通过介导H3cit蛋白形成而促进了AKI病程的进展,经PAD4抑制剂BB-Cl-amidine干预后,H3cit水平降低,同时也降低了氧化应激水平,有助于缓解肾脏损伤。