苯乳酸的研究进展

程一凡,刘念丽,侯 颖

(1.天津科技大学 生物工程学院,天津 300457;2.沂水县第二中学,山东 临沂 276400)

近年来,食品安全成为人们关注的热门话题。中国作为世界第一人口大国,对食品的需求量也是巨大的。食品在加工、运输及储存中极易受到微生物污染而腐败变质,因此食品防腐无论是对人们的日常生活及身体健康还是对经济的发展都影响巨大。食品防腐剂使用较为广泛,主要分化学防腐剂和生物防腐剂。化学防腐剂如山梨酸、苯甲酸、对羟基苯甲酸酯类等[1],有研究证实化学防腐剂不仅会对人体健康有一定的危害,而且会破坏食品本身的营养成分[2]。生物防腐剂如苯乳酸(Phenylactic acid,PLA)、纳他霉素、果胶低聚糖等[3-4]相较于化学防腐剂而言更加天然和安全,是食品防腐的不二选择[5]。PLA是一种具有广谱抗菌作用的新型生物防腐剂[6-7],目前其合成主要有化学合成法和微生物转化法。化学合成法的制备存在诸多缺点,如工艺流程繁琐、在生产过程中会出现副产物以及会污染环境等[8-10]。微生物转化法具有生产条件较温和、原料成本较低等优点。笔者主要从PLA的理化性质、生产途径及应用等方面进行综述,旨在为PLA的生产及食品防腐行业提供新思路。

1 PLA理化性质及抑菌机制

1.1 PLA结构

PLA为2-羟基-3苯基丙酸,又称为β-苯基乳酸或3-苯基乳酸,是一种天然小分子有机酸,化学式为C9H10O3,相对分子质量是166.17,熔点为121～125 ℃[11],在水中溶解度较好,且耐酸耐热。PLA最初提炼于发酵食品及蜂蜜,纯度较高时为白色晶状体,性质比较稳定,应用前景广阔。PLA的第2个碳原子为手性碳原子,存在2种对映异构体,即L-PLA和D-PLA。有研究表明:虽然这两种异构体除空间结构不同以外,其他的性质如熔点、沸点和相对密度等大多相同,但是其抑菌效果却存在差异,D-PLA的抑菌效果优于L-PLA[12]。PLA对映异构体的化学结构为

1.2 PLA抑菌机理

目前对抑菌物质的研究主要集中在细胞、分子以及能量代谢水平上。细菌的细胞壁具有保护作用,能够提高细胞的机械强度,保护细胞免受机械损伤和渗透压等外力的破坏,其主要成分是肽聚糖,肽聚糖由N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸2种氨基糖经β-1.4糖苷键间隔排列而形成的多糖支架。溶菌酶是一种能水解细菌中黏多糖的碱性酶,通过破坏肽聚糖中的β-1,4糖苷键,使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽,导致细菌细胞壁破裂、内容物逸出而溶解。陆永祥等[13]认为PLA的抑菌作用位点是细胞壁,其抑菌机理与溶菌酶相似。细胞膜主要由脂质(磷脂)、蛋白质和糖类等物质组成,其不仅能够控制物质进出细胞从而使细胞进行基本的生命活动,还能维持细胞内环境的相对稳定。宁亚维等[14]研究了PLA对荧光假单胞菌的抑菌机制,提出PLA通过破坏荧光假单胞菌的细胞膜以及DNA发挥抑菌作用,消散荧光假单胞菌的跨膜电位,使细胞膜的通透性增加,导致胞内K+外露,细胞膜的完整性遭到破坏,细胞形态改变,胞体内容物外泄,菌体粘连。此时细胞生存必不可少的物质如蛋白质和核酸发生泄漏,细胞膜也失去了支撑及保护功能,细胞生命力逐渐减弱,走向死亡[11]。Wang等[15]分别用1.25,2.50,5.00,10.00 mg/mL的PLA处理粪肠杆菌细胞30 min,发现用10 mg/mL的PLA处理的粪肠杆菌细胞的OD260数值显著高于用其他质量浓度的处理结果,这一结果表明:随着PLA质量浓度的增加,细胞膜的损伤越来越严重。

在分子水平上,细胞的正常生命活动离不开蛋白质的参与,蛋白质的合成车间是核糖体,PLA能够和核糖体上的与蛋白质合成相关的亚基结合,影响蛋白质的正常生成,此时细胞的正常生命活动及代谢受到抑制,进一步抑制了细菌的增长和繁殖。宁亚维等[14]通过实验得出结论:PLA在进入胞内后可以破坏DNA结构,阻碍基因的表达,从而抑制了荧光假单胞菌的正常生长与繁殖。

2 PLA的生产途径

2.1 化学合成法

邓喜玲等[16]以苯甲醛和对羟基苯甲醛为起始原料合成PLA和羟基苯乳酸;Mu等[17]先通过乙醛与乙酰基甘氨酸合成吖内酯,再通过混合锌与盐酸还原水解获得PLA;李光兴等[18]通过Raney-Ni合金催化还原羟基苯丙酮酸制备羟基苯乳酸;Van Draanen等[19]使用SN2对苯丙氨酸进行催化合成苯乳酸。

PLA化学合成法存在着许多缺点,例如在合成PLA的过程中生成的副产物较多,工艺路线复杂,控制条件相对苛刻,对环境的污染比较严重,在反应过程中需要大量的有机溶剂等。此外,PLA化学合成法最主要的问题是通过化学合成得到的消旋体L-PLA和D-PLA难以分离,纯化步骤较为繁琐且增加了成本。

2.2 生物合成法

由于化学合成法生产PLA的缺点较多,不能进行大规模的生产以及工业化的应用,因此PLA的生物合成法成为人们研究的焦点。PLA的生物合成法有2种:微生物发酵法和全细胞转化法。

2.2.1 微生物发酵法

PLA可由多种微生物发酵生产获得。Lavermicocca等[20]实验发现:在受污染的烘焙食品中分离出来的植物乳杆菌21B(L.plantarum21B)的培养液中鉴定出含有PLA的抗真菌化合物,其质量浓度高并具有较高活性,产量为56 mg/L。L.plantarum21B表现出非常广谱的抑菌活性,抑制了几乎代表导致烘焙食品污染的最常见的所有种类真菌的活性,如EurotiumrepensIBT18000,E.rubrumFTDC3228,PenicilliumcorylophilumIBT6978,P.roquefortiIBT18687,P.expansumIDM/FS2等真菌,抑制率超过86%。Rodríguez等[21]研究了5种乳酸菌(Lactic acid bacteria,LAB)生产PLA的能力,研究结果表明PLA产量最高的是L.plantarumCECT-221[21]。邵宇[22]在2 L的发酵罐中进行7 d的发酵生产,产量最高可达到700 mg/L。Lakshmi Prasuna等[23]对光合细菌产生L-PLA进行了研究,结果表明:当一种光养细菌(RubrivivaxbenzoatilyticusJA2)以L-Phe为唯一的氮源进行生长时,L-PLA的产量比L-Phe作为附加氮源(0.15 mmol/L)时高(0.45～0.70 mmol/L);当L-Phe的浓度小于4 mmol/L时,L-PLA的产量与L-Phe的浓度呈正相关;当L-Phe的浓度大于4 mmol/L时,PLA的产量达到最高并保持稳定。李兴峰等[24]从泡菜中筛选出一株乳杆菌(Lactobacillussp.)SK007,其可产生0.55 mmol/L的苯乳酸;并且证明了PLA合成的限制因素是Phe的转氨反应,如果用苯丙酮酸(Phenylpyruvic acid,PPA)作为底物代替Phe合成PLA,那么PLA的产量能够提高11倍,发酵时间可以缩短48 h。

Schwenninger等[25]在利用不同细菌进行联合发酵时发现PLA的产量明显提高,若将乳酸菌PropionibacteriumjenseniiSM11与丙酸菌Lactobacillusparacaseisubsp.paracaseiSM20进行联合发酵,PLA的产量能达到0.166 g/L。田雪娇等[26]通过用亚硝基胍(Nitrosoguanidine,NTG)对L.plantarumLY-78进行诱变时发现:当NTG的质量浓度为1.0 mg/mL时,作用40 min后得到变异菌株NY-34,发酵液中PLA的最高产量为648 mg/L,比出发菌株的产量增加2.63倍,并且突变株NY-34具有较好的稳定性。随着生物分子技术的迅速发展,可以通过在分子水平上对天然菌株的基因进行定向改造以获得PLA高产突变菌株。邓廷山等[27]通过使用CRISPR/Cas9基因编辑系统将一株干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)1.8727的芳香族氨基转移酶基因arat敲除,得到重组菌株(L.casei)1.8727Δarat,将此重组菌株发酵72 h,测定其PLA的产量比其出发菌株提高约66.7%,且arat基因的缺失并不会抑制PLA的合成代谢,说明PLA的代谢合成步骤不仅受到arat基因的调控,还可能有多个基因参与,是一个复杂的代谢网络。

2.2.2 全酶催化法合成PLA

微生物发酵法比化学合成法过程简单,然而也存在很多缺点,如产率较低、在生产过程中很多条件不易控制、菌体生长慢导致发酵周期较长以及发酵液成分较复杂不利于PLA分离提取等。尽管近年来人们不断地筛选PLA的高产菌株,还是不能使PLA的产量得到很大提高,难以进行PLA的大规模工业化生产,因此人们将对PLA的高产研究转向了生物催化法。生物催化法可分为全酶转化法和全细胞转化法,其中全细胞转化法应用较为广泛。

苯乳酸的合成途径主要分为2步:先将Phe转化为PPA,再由PPA生成PLA。第一步反应可由氨基转移酶、D-氨基酸氧化酶、L-氨基酸脱氨酶(L-amino acid deaminase,L-AAD)进行催化,并且需要α-酮戊二酸的参与。由于氨基转移酶需要添加α-酮戊二酸,因此会增加生产成本;此外D-氨基酸氧化酶催化PLA生成会产生过氧化氢,对反应体系中的酶和产物具有毒害作用[28]。在L-AAD在催化过程中不需要α-酮戊二酸的参与且不生成过氧化氢,因此利用L-AAD催化其成本更低且更加安全。第二步反应可由乳酸脱氢酶(Lactatedehydrogenase,LDH)、芳香族羟基酸脱氢酶、异己酸脱氢酶等酶催化,其中LDH具有较高的酶活力,且不同菌株来源的LDH对反应的催化活性不同。Zheng等[29]研究发现:BacilluscoagulansNL01菌株中含有的L-LDH能够催化PPA进行还原反应生成PLA。因此筛选高活力的LDH是PLA高产的关键[21]。PHE合成PLA的途径为

贾江花[30]通过实验得知L.plantarumSK002菌株中L-LDH和D-LDH均是由丙酮酸生物转化为PLA的有效催化剂,L-乳酸脱氢酶最适pH为6.0,最适温度为40 ℃;D-LDH的最适pH为6.0,最适温度为30 ℃,L-乳酸脱氢酶具有较高的温度和pH稳定性。Xu等[31]在Lactobacillussp.CGMCC 9967中鉴定出一种依赖NADH的苯丙酮酸还原酶(Pphenylpyruvate reductase,LaPPR),该酶是一种高效合成D-PLA的生物催化剂,其能够将苯丙酮酸还原为D-PLA,产物分离率为91.3%,D-PLA产率为243 g/L。Fujii等[32]发现了能够产生PLA的荧光威克酵母菌TK1,在其细胞提取物中纯化出PPR,克隆了pprA基因并在大肠杆菌细胞中进行表达,结果表明PPR能够有效地将PPA转化为PLA。

2.2.3 全细胞催化法

全细胞催化是指利用完整的细胞作为催化剂生产目的产物,该法比全酶催化在实际工业生产中的应用更为广泛。细胞内完整的多酶体系可以实现酶的级联反应,从而省去繁琐的酶的纯化步骤。由于全酶催化过程中酶的反应条件温和,游离的酶容易失活,因此反应需要在严格的环境中进行,而全细胞催化剂的酶处于细胞中,受外界环境的影响较小。因此从长远来看,全细胞催化剂比游离的酶更加稳定,并且制备更加简单,生产成本更低。

Hou等[33]对来自奇异变形杆菌的L-AAD进行纯化,使L-Phe一步转化生成PPA,另外对比了利用纯酶催化和重组大肠杆菌全细胞生物催化两种方法生成PPA的优势。实验结果表明全细胞催化生成PPA有3个优点:首先L-AAD一旦从膜上分离下来就会变得不稳定,这对许多酶来说仍然是一个很大的缺点,然而全细胞催化剂在4 ℃下保存数天后活性几乎没有下降,只有在长时间的操作条件下,活性才会逐渐降低;其次与纯酶催化剂相比,全细胞催化剂在L-Phe转化为PPA的过程中具有更好的热稳定性;最后由于辅助因子循环系统存在于完整细胞中,所以在全细胞催化系统中无须外部添加辅助因子。Zheng等[29]在BacilluscoagulansNL01中提取了一种依赖NAD的L-LDH,该酶被证实具有良好的催化PPA生成L-PLA的能力,并且在研究中使L-LDH基因和甲酸脱氢酶基因在大肠杆菌中进行异源共表达。通过两次耦合反应,82.8 mmol/L的PPA在40 min内可合成79.6 mmol/L的L-PLA。

3 PLA的应用

3.1 PLA在食品中的应用

随着经济能力的提升,消费者逐渐把目光从食品价格转移到食品安全上来,对食品安全的需求日益增加。一方面,化学防腐剂在抑制食品中微生物方面的效果没有生物防腐剂好;另一方面,化学防腐剂有危害健康的潜在风险,根据食品监管限制,要求使用来源更加安全的新型有效抗菌素。PLA作为一种新型、安全的天然生物广谱抑菌物质,具有较高的安全系数、稳定性以及较强的抑菌能力和防止食物腐败能力,具有广阔的发展前景。

郭宇逍等[34]研究发现:苯乳酸作为天然杀菌剂在控制柑橘采后发生绿霉病变方面具有良好的应用潜力和开发前景;孔祥丽等[35]发现L-PLA具有对具核梭杆菌(Fusobacteriumnucleatum,FN)的抑制效果及抗癌效果,为通过食用天然生物酸预防癌症提供了研究方向;杜娜娜[36]发现PLA对米根霉有很好的抑制作用,百合是兰州特色农作物,而米根霉是引起百合鳞茎软腐病的主要腐败菌,因此PLA对农作物的储存极具意义。

3.2 PLA在医药行业中的应用

丹参素(β-3,4-二羟基苯基乳酸钠)是丹参注射液的主要有效成分,可以用于治疗冠心病和血管类疾病,并且已经被广泛地用于临床治疗,然而丹参来源有限,提取分离步骤繁杂。有实验表明:PLA与丹参素的药理作用相似,且有体外抗血小板聚集活性、降低血液的黏稠度等作用[37]。PLA是生产恩格列酮的原料,恩格列酮可诱导产生适量胰岛素,以降低血糖浓度,可有效治疗心血管并发症及糖尿病[38]。此外,PLA还能够用于合成非蛋白氨基酸,以及制成降血糖剂和抗HIV试剂等[39]。

3.3 PLA在其他行业中的应用

PLA还可以应用于化妆品、饲料和养殖等行业。果酸经常被用于化妆品行业,而PLA作为果酸的一种,不仅有除皱、保湿、美白及淡斑功效,还能够作为防腐剂防止微生物污染以此延长护肤产品的保质期[40]。在养殖行业,饲料防腐剂添加不当时会导致抗菌药物残留超标,适当添加PLA可延长饲料存放时间。有实验表明:在家畜的饲料中添加一定量PLA一段时间后发现这些家畜体内的大肠杆菌数量下降,个体生长也得到了明显改善[41]。

4 结论和展望

PLA在多个行业都具有很强的应用潜力,然而目前国内外对PLA的研究主要集中在菌种的筛选以及对生产条件的优化,对其如何抑菌、是否存在其他的作用靶点以及在菌体内的调控机制都研究甚少。对微生物中PLA的合成与分解代谢途径以及对PLA的抑菌机制进行深入研究,为今后PLA合成和工业化应用提供十分重要的理论基础而对PLA的抑菌机制以及其高产量菌株的筛选与定向改造还待进一步探究。