顺序和同时接种乳酸菌对马瑟兰葡萄酒品质的影响

贾世宽，陈佳威，郜成军，薛楚然，王颉*，刘亚琼*

（1.河北农业大学食品科技学院，河北 保定 071000；2.中国长城葡萄酒有限公司，河北 怀来 075400）

葡萄酒酿造主要包括两个阶段，即酒精发酵（alcoholic fermentation，AF）和苹果酸-乳酸发酵（malolactic fermentation，MLF），是由酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）、非酿酒酵母（non-Saccharomycescerevisiae）和乳酸菌（lactic acid bacteria）共同作用的结果[1]。在酒精发酵阶段，酿酒酵母起到至关重要的作用，其将糖转化为乙醇和CO2，并形成许多葡萄酒代谢物，包括高级醇和酯类，该阶段对葡萄酒的口感和总体质量产生较大影响[2]。

传统的酿酒工艺通常是在酒精发酵结束后，接种乳酸菌来诱导MLF，将L-苹果酸转化为L-乳酸和CO2，以此降低葡萄酒中苹果酸的含量、提高微生物稳定性[3]。目前只有乳杆菌属（Lactobacillus）、酒酒球菌属（Oenococcus）、明串珠菌属（Leuconostoc）以及片球菌属（Pediococcus）这4 种乳酸菌属在酿酒环境中生存，其中酒酒球菌（Oenococcusoeni，O.oeni）已经被广泛用作商业发酵剂启动苹果酸-乳酸发酵[4]。然而，酒精发酵结束后，低pH 值和高乙醇含量以及葡萄酒中营养物质的减少会明显抑制乳酸菌的生长，从而延长苹果酸-乳酸发酵时间[5]。为克服低pH 值和高乙醇含量对乳酸菌的抑制作用并缩短苹果酸-乳酸发酵周期，有研究表明在葡萄汁中同时接种S.cerevisiae和O.oeni可诱导苹果酸-乳酸发酵，且不会增加葡萄酒的挥发性酸[6]。

非酿酒酵母被认为是导致葡萄酒败坏的微生物，会产生不良风味，影响葡萄酒的品质。但相关的研究表明，非酿酒酵母与酿酒酵母混合发酵可以提高葡萄酒的香气复杂性和感官属性[7]。目前毕赤酵母（Pichia fermentans）、戴尔有孢圆酵母（Torulasporadelbrueckii）、有孢汉逊酵母（Hanseniasporauvarum）等已被用作商业酿酒发酵剂[8-10]。其中，戴尔有孢圆酵母在酿酒条件下具有高代谢活性以及对乙醇和SO2的抗性，是葡萄酒酿造中最常使用的非酿酒酵母[11-12]。有研究表明，戴尔有孢圆酵母与酿酒酵母顺序接种发酵可促进脂肪酸乙酯的合成，对葡萄酒生产具有协同作用[13]。

近年来，酿酒酵母与乳酸菌同时接种的研究日益增多，但与非酿酒酵母同时发酵会对葡萄酒的风味品质产生何种影响鲜有报道。本文以马瑟兰葡萄为原料，研究戴尔有孢圆酵母、酿酒酵母和乳酸菌在不同接种方式下混合发酵对马瑟兰葡萄酒基本理化指标以及挥发性香气物质的影响，探索葡萄酒多菌种发酵的可行性和新模式，促进葡萄酒风味的改善。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

马瑟兰葡萄：2021年10月采自河北张家口中国长城葡萄酒（怀来）有限公司葡萄园，果实含糖量251.73 g/L（以葡萄糖计），含酸量5.33 g/L（以酒石酸计），pH3.49。

酿酒酵母（S.cerevisiae）XR：法国LAMOTHE ABIET 公司；非酿酒酵母（Torulasporadelbrueckii）NS-D：安琪酵母股份有限公司；乳酸菌（O.oeni）OENO 1：宁夏诺盟生物科技有限公司。

3-辛醇（标准品）：美国Sigma 公司；果胶酶（食品级）：法国LAFFORT 公司；氯化钠（分析纯）、偏亚硫酸钾（食品级）：国药集团化学试剂有限公司；柠檬酸、磷酸（均为分析纯）：天津市北辰方正试剂厂；有机酸混合标准品（苹果酸、乳酸、柠檬酸、酒石酸、琥珀酸）：北京索莱宝生物科技有限公司；甲醇（色谱纯）：北京迪科马科技有限公司。

1.2 仪器与设备

7890B-5977A 气相色谱质谱联用仪：美国Agilent公司；57328-u 顶空固相微萃取纤维头：美国Supelco公司；HP-INNOWAX 毛细管色谱柱（60 m×250 μm，0.25 μm）：美国Agilent 公司；Autosampler2707 高效液相色谱仪：美国Waters 公司；葡萄酒成分分析仪Wine Scan FT 120：丹麦FOSS 公司；T6 新世纪紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；NomaSense color P100 色差计：法国Nomacorc 有限公司；PHS-3E pH 计：济南欧莱博技术有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 发酵方法

挑选新鲜马瑟兰葡萄40 kg，除梗破碎后将果浆分别置于9 个5 L 的发酵罐内（每个处理3 罐，每罐4 L葡萄浆）；分别加入50 mg/L 果胶酶和100 mg/L 焦亚硫酸钾，在4 ℃下冷浸渍48 h 后进入发酵阶段。测定发酵液中的糖含量，当酒样的残糖小于4 g/L 时，酒精发酵结束，取样保存于-20 ℃。苹果酸-乳酸发酵阶段测定酒样中苹果酸的含量，当苹果酸含量小于0.5 g/L时，苹果酸-乳酸发酵结束，取样保存于-20 ℃。采用顺序接种处理（sequential inoculation，SEQ）和同时接种处理（simultaneous inoculation，SIM）两种处理方法，自然发酵为对照组（control，CK）。不同处理酒样的酒精和苹果酸-乳酸发酵阶段试验方法如表1所示。

表1 试验设计方法Table 1 Test design method

1.3.2 理化指标测定方法

葡萄酒总糖、总酸和酒精度等基本理化指标利用葡萄酒成分分析仪测定，透射扫描波数5 012～926 cm-1；pH值采用pH 计法测定，取10 mL 离心（40 ℃，8 000 r/min，10 min）后的葡萄酒，用数字pH 计测定。

色泽测定方法：酒样经离心（40 ℃，8 000 r/min，10 min）后过0.45 μm 水系滤膜，滤液加入1 cm 比色皿中，用色差计测定L*值、a*值和b*值，以蒸馏水为标准值，记为L0*值、a0*值、b0*值，参考Barreiro 等[14]的方法计算酒精发酵结束色差（ΔE*），计算公式如下。

ΔE*=[（L*-L0*）2+（a*-a0*）2+（b*-b0*）2]1/2

ΔE*与观察感觉的关系[15]如表2所示，上述试验每个样品重复测定3 次。

表2 色差感官评价Table 2 Color different sensory evaluation

1.3.3 挥发性化合物测定方法

挥发性化合物的测定参照夏亚男等[16]方法，并稍作修改。顶空固相微萃取：样品解冻后，吸取7.5 mL 葡萄酒，加入20 mL 顶空瓶中，同时加入10 μL 的3-辛醇（300 mg/L）和1 g NaCl，40 ℃水浴预平衡15 min 后，插入萃取头吸附40 min，于气相色谱仪进样口解吸6 min。

色谱分析条件：柱温箱的升温程序为50 ℃保持2 min，然后以3 ℃/min 的速率升至80 ℃，再以5 ℃/min速率升至230 ℃，持续6 min。采用不分流进样，进样口温度为240 ℃，载气He，流量为1 mL/min。质谱条件：电子轰击电离源，电子能量70 eV，离子源温度为230 ℃，四极杆温度为150 ℃。溶剂延迟时间8 min，总离子流扫描范围35～550 m/z。

定性定量分析：采用保留指数和质谱扫描图谱与NIST14.L 谱库进行比对定性，对匹配度80%以上的组分进行筛选，确认香气物质的各个化学成分。各成分的含量采用内标法进行半定量，选用3-辛醇作为内标物质。

1.3.4 有机酸测含量测定方法

参照GB 5009.157—2016《食品安全国家标准食品中有机酸的测定》测定[17]，并稍作修改。色谱柱：C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：A 为纯甲醇，B 为0.1%磷酸溶液；流速：1.0 mL/min；进样量：20 μL；检测器波长：220 nm；柱温：40 ℃；梯度洗脱程序：0～4 min，90%～90%B；4～5 min，90%～40%B；5～7 min，40%～10%B；7～9 min，10%～10%B；9～10 min，10%～90%B。

1.3.5 感官评价方法

感官评价小组成员由葡萄酒生产企业具有品酒师资质的人员和研发人员共11 人组成（女性7 人，男性4 人，年龄29～65 岁，平均40 岁），分别从酒样的外观（颜色、澄清度）、口感（酸度、甜度）、香气（浓郁度、典型性、氧化味）和总体评分4 个方面对各葡萄酒样品进行感官评价，评分范围从0（弱）～10（最大强度），感官评价结果为所有评估小组成员得分的平均值。

1.4 试验结果统计分析方法

试验结果以平均值±标准差形式表示，采用SPSS 26 软件进行方差分析和Duncan 多重比较，显著性水平P＜0.05；使用Origin 2021 软件绘图，SIMCA 14.0 软件进行主成分分析。

2 结果与分析

2.1 不同试验处理对马瑟兰葡萄酒主要理化指标的影响

不同试验处理对马瑟兰葡萄酒主要理化指标的影响如表3所示。

表3 不同试验处理对马瑟兰葡萄酒主要理化指标的影响Table 3 Effects of different experimental treatments on main physical and chemical indexes of Marselan red wine

由表3 可知，SEQ、SIM 和CK 3 个处理组的酒精发酵均在12 d 时结束，苹果酸-乳酸发酵时间分别为38、34 d 和45 d，所有处理组苹果酸-乳酸发酵结束后总糖含量均小于4 g/L，酒精度在13.71%vol ～13.79%vol。

从表3 还可看出，SEQ 组和CK 组的总糖含量显著高于SIM（P＜0.05）；不同试验处理对马瑟兰葡萄酒酒精度的影响差异不显著；CK 组的总酸含量显著高于SEQ 和SIM 处理（P＜0.05），这与之前的报道一致，自发MLF 的葡萄酒总酸含量较高[18]。有研究表明，酒酒球菌与酿酒酵母同时接种可有效缩短蛇龙珠葡萄酒发酵周期，在共发酵过程中的发酵环境更有利于酒酒球菌生长[19]。

不同试验处理对马瑟兰葡萄酒颜色变化的影响如表4所示。

表4 不同试验处理对马瑟兰葡萄酒色差的影响Table 4 Effects of different experimental treatments on the color change of Marselan red wine

从表4 可见，葡萄汁和SEQ、SIM 和CK 处理马瑟兰葡萄酒之间的色差分别为50.00、58.43 和49.62，色差均超过12，为不同颜色；CK 和SEQ 处理马瑟兰葡萄酒的色差为3.49，颜色差异明显；CK 与SIM 处理马瑟兰葡萄酒的色差为9.97，颜色差异明显；SEQ 和SIM 处理马瑟兰葡萄酒的色差为8.5，颜色差异明显。不同接种方式下发酵的葡萄酒的色差差异明显，代表不同的颜色。

2.2 不同试验处理对马瑟兰葡萄酒有机酸含量的影响

不同试验处理对马瑟兰葡萄酒有机酸含量的影响如表5所示。

表5 不同试验处理对马瑟兰葡萄酒有机酸含量的影响Table 5 Effect of different experimental treatment on organic acid content of Marselan red wine g/L

由表5 可知，酒精发酵结束和苹果酸-乳酸发酵结束时，不同处理对马瑟兰葡萄酒有机酸含量的影响差异极显著（P＜0.01）。马瑟兰葡萄汁中主要有机酸含量从高到低依次为苹果酸、酒石酸、琥珀酸和柠檬酸。葡萄浆果中含有大量的酒石酸，是葡萄酒酸味的主要来源之一[20]。酒精发酵结束后，葡萄酒中除乳酸外，各处理的酒石酸和苹果酸含量均低于葡萄汁，这可能与戴尔有孢圆酵母具有较强的降解苹果酸和酒石酸能力有关[21]。SIM 的柠檬酸和琥珀酸含量均显著高于SEQ和CK 处理（P＜0.05），琥珀酸作为苹果酸-乳酸酶的抑制剂，会对MLF 有负面影响[22]。在酒精结束后，仅在SIM 处理组检测到乳酸的生成。

苹果酸-乳酸发酵结束后不同处理组苹果酸含量均小于0.5 g/L，其中SIM 处理苹果酸含量显著低于其它处理（P＜0.05），降酸效果较好，乳酸含量显著高于其它处理组（P＜0.05），有助于调整葡萄酒的整体酸度。乳酸与苹果酸和酒石酸相比阈值更高，口感比苹果酸更柔和，会对葡萄酒口感产生积极影响[23]。CK 处理组酒石酸和柠檬酸含量均显著高于SEQ 和SIM 处理（P＜0.05），琥珀酸和乳酸则显著低于SEQ 和SIM 处理（P＜0.05）。葡萄酒发酵过程中O.oeni直接参与三羧酸（tricarboxylic acid cycle，TCA）循环，用来消耗柠檬酸从而产生乙酸、乳酸和双乙酰物质，双乙酰是产生独特的黄油风味的化合物，这是MLF 期间葡萄酒中最明显的风味变化之一[24]。发酵结束后，SEQ 和SIM 处理组具有较高的琥珀酸含量，有研究表明，一些乳酸菌可以消耗苹果酸、柠檬酸和酒石酸并将其代谢为琥珀酸[25]。

2.3 不同试验处理对马瑟兰葡萄酒中挥发性物质的影响

不同试验处理对马瑟兰葡萄酒挥发性成分香气含量的影响如表6所示。

表6 不同试验处理对马瑟兰葡萄酒挥发性香气成分含量的影响Table 6 Effect of different experimental treatment on the content of volatile aroma components in Marselan red wine

由表6 可知，酒精和苹果酸-乳酸发酵结束时酒样中共检测出30 种挥发性香气化合物，包括14 种酯、11 种醇、3 种脂肪酸和2 种其他化合物。SIM 挥发性成分含量显著高于其它处理（P＜0.05），为8 871.25 μg/L，SEQ 处理和CK 挥发性成分含量分别为8 741.28 μg/L和8 714.82 μg/L。

2.3.1 不同试验处理对酯类物质的影响

酯类在葡萄酒的香气复杂性中起主要作用，对葡萄酒中水果香气特征具有积极贡献[26]。酒精发酵结束时，SIM 处理的酯类含量（4 637.29 μg/L）显著高于SEQ处理和CK（P＜0.05），这与Capozzi 等[27]研究结果一致，在酒精发酵初期同时接种乳酸菌可以增加酯类含量，从而增强果香。与酒精发酵结束相比，苹果酸-乳酸发酵结束后不同处理葡萄酒的酯类含量均有所降低。SIM 处理的癸酸乙酯（椰子果香）、己酸乙酯（青苹果、花香）和9-癸烯酸乙酯含量显著高于CK 和SEQ 处理（P＜0.05），具有较强的产脂肪酸乙酯能力。

苹果酸-乳酸发酵结束时，SIM 处理酯类含量显著高于SEQ 处理和CK 处理（P＜0.05），同时接种乳酸菌有助于增加葡萄酒的酯类含量。苹果酸-乳酸发酵结束后，各处理组的琥珀酸二乙酯含量与对照组相比均有增加，这是由于苹果酸-乳酸发酵阶段代谢葡萄酒中琥珀酸从而转化为琥珀酸二乙酯，导致其含量升高[28]。其中辛酸乙酯是所有脂肪酸乙酯中含量最高的化合物，有研究表明酿酒酵母与T.delbrueckii混合发酵可有效提高葡萄酒产辛酸乙酯能力，赋予葡萄酒愉悦的水果风味[8]。与CK 组相比，SEQ 和SIM 处理的葡萄酒中乳酸异戊酯含量较高，而CK 组未检测出。

2.3.2 不同试验处理对醇类物质的影响

表6 结果表明，苹果酸-乳酸发酵结束时，对照组CK 的高级醇含量显著高于SIM 和SEQ 处理（P＜0.05）。醇类物质是葡萄酒挥发性成分的主要成分，占总挥发性香气60%以上。高级醇由氨基酸通过Ehrlich 途径或糖代谢Harris 途径生成。高级醇通过Ehrlich 途径由糖及其相应氨基酸的代谢产生[29]。苹果酸-乳酸发酵后的高级醇含量高于酒精发酵结束，苹果酸-乳酸发酵过程中会增加葡萄酒中氨基酸的含量，葡萄酒中增加的氨基酸能转化为高级醇，从而增加醇含量[25]。本试验中共检测出9 种高级醇，异戊醇是所有醇类物质中占比最高的物质。苹果酸-乳酸发酵结束时，CK 中异戊醇含量显著高于其它处理（P＜0.05），可能会给葡萄酒带来酒精味、溶剂味和指甲油等不良气味[30]。SIM 处理2，3-丁二醇（黄油味）含量最高，同时接种发酵有助于双乙酰的降解，使葡萄酒的香气更加复杂，并对香气和感官质量有积极的贡献[31]。与酒精发酵相比，苹果酸-乳酸发酵的葡萄酒正己醇含量均有明显增加，赋予葡萄酒青草和植物味道。

2.3.3 不同试验处理对其它挥发性物质的影响

苹果酸-乳酸发酵结束时，不同试验处理对马瑟兰葡萄酒挥发性物质总量的影响差异显著（P＜0.05）。挥发性脂肪酸是发酵过程酵母和乳酸菌代谢产生的副产物，尽管在葡萄酒中微量存在，但其刺激性气味和低阈值使其成为必需的香气贡献者。与AF 相比，MLF 发酵的葡萄酒中乙酸含量增加，主要原因是酒酒球菌对糖的异源利用以及柠檬酸代谢[24]。苹果酸-乳酸发酵后SEQ和CK 处理己酸含量低于酒精阶段，己酸乙酯含量却高于酒精发酵，有研究表明在发酵过程中脂肪酸会转化为相应的脂肪酸乙酯[32]。由乳酸菌指导的SEQ 和SIM 在发酵结束后未检测出挥发性酚，有效降低了不良风味的影响，这与Devi 等[33]研究结果一致。本试验中在苹果酸-乳酸发酵阶段检测出1 种萜类化合物大马士酮，CK 中大马士酮含量最高，主要呈现玫瑰、铃兰等花香[34]。

2.4 主成分分析

不同接种方式香气物质的主成分分析如图1所示。

图1 香气化合物主成分分析的因子载荷图Fig.1 Factor load diagram of principal component analysis of aroma compounds

由图1 可知，PC1 和PC2 分别占47.1%和31.4%，累计贡献达到78.5%。对照组CK 挥发性化合物可与PC1 上的SIM 和SEQ 区分开，而SIM 处理可以进一步与PC2 上的SEQ 区分开。SIM 主要分布在第四象限，并与正PC1 的变量密切相关。乳酸菌同时接种处理对一些重要酯类如Y1（乙酸己酯）、Y2（乙酸异戊酯）、Y9（己酸乙酯）、Y11（9-癸烯酸乙酯）表现出较高强度，主要是为葡萄酒贡献了比较浓郁的果香和花香。CK 主要分布在第二和第三象限，CK 受与负PC1 强相关的变量影响更大，其中Y10（十二酸乙酯）、Y13（己酸异戊酯）、Y18（顺-3-己烯醇）、Y23（异丁醇）和Y30（2，5-二叔丁基酚）的相关性较高。SEQ 位于第一象限，表现出与Y5（辛酸乙酯）相关性较高，赋予葡萄酒白兰地和果香味。

2.5 不同试验处理对马瑟兰葡萄酒感官评分的影响

不同试验处理对马瑟兰葡萄酒感官评分如图2所示。

图2 马瑟兰葡萄酒感官评分Fig.2 Sensory score of Marselan red wine

由图2 可知，不同试验处理对马瑟兰葡萄酒澄清度、甜度和典型性的影响无明显差异。马瑟兰葡萄酒的颜色主要呈深宝石红色，其中SIM 处理色泽评分更高。在口感方面，SEQ 和SIM 处理酸度得分略高于CK，这与上述理化指标结果基本一致。香气方面，SIM处理浓郁度评分更高些，果香味更明显。CK 溶剂味略高于SEQ 和SIM 处理，这可能与葡萄酒较高的异戊醇含量有关。在总体评价方面，SIM 处理风味接受度略高于其它处理组，具有良好的口感和较为浓郁的果香。

3 结论

本文主要研究乳酸菌与酿酒酵母、非酿酒酵母顺序和同时接种对马瑟兰葡萄酒基本理化指标、有机酸、挥发性成分和感官特性的影响。不同试验处理均能完成酒精发酵和苹果酸-乳酸发酵，总糖、总酸、酒精度均达到国家标准；SIM 处理能够缩短发酵周期，且降低苹果酸的效果较好，促进大量果香酯的合成，增加葡萄酒香气，并改善葡萄酒口感。本试验结果为马瑟兰葡萄酒的品质调控提供了新的思路和借鉴，但发酵过程中微生物间的相互作用机制还有待进一步深入研究。