囊胚玻璃化冷冻对小鼠及其子一代的行为学影响与发育评估*

高 原，王生存，刘晓军，丁梦倩，曾旭辉，张小宁***，郭 丰

（1 南通大学实验动物中心，南通 226001；2 南通大学附属医院生殖医学中心；3 南通大学医学院）

胚胎玻璃化冷冻和冻融胚胎移植是人类辅助生殖技术（assisted reproductive technology,ART）中重要且必不可少的技术，玻璃化冷冻技术因操作简单和复苏成活率高，近年来被广泛应用[1-2]。为增加辅助生殖治疗的成功率，临床上通常使用超促排卵技术，1个周期可获得多枚胚胎，移植后多余胚胎冷冻保存。近年来越来越多的辅助生殖机构选择全胚冷冻。与新鲜胚胎移植相比冷冻胚胎移植具有多项优势，可规避刺激周期高雌激素对子宫内膜的不利影响，同时可降低新鲜周期卵巢过度刺激综合征的风险[3]，还可增加每个ART 周期的累积妊娠率和抱婴率。

自2010 年首例玻璃化冷冻胚胎复苏婴儿出生至今，国内外应用玻璃化冷冻技术已诞生了许多婴儿[4-5]。因胚胎玻璃化冷冻使用高浓度冷冻保护剂，对子代的安全性值得关注。玻璃化冷冻对胚胎复苏成活率、种植率和围生期的影响已有大量研究[6-7]，结果表明玻璃化冷冻不影响胚胎复苏率和种植率，对胎儿发育和新生儿各生理指标也均无不良影响[8-9]。然而胚胎玻璃化冷冻对子代儿童期和成年后的影响研究不多。由于胚胎玻璃化冷冻是一项全新的技术，临床广泛使用仅十多年，这些孩子大多仍处于儿童期，目前没有通过冷冻保存技术出生儿童的长期随访数据[10]。对这些儿童的体格生长、神经精神系统以及生殖系统发育的长期随访，确保胚胎玻璃化冷冻技术的长期安全性极其重要。

小鼠是人类疾病研究的重要工具，生命周期短，可在短时间内进行各阶段生命周期特征研究。本研究不仅对C57BL/6 小鼠囊胚玻璃化冷冻复苏移植出生小鼠的多系统发育和功能指标进行研究，而且对囊胚冷冻小鼠的子一代也进行了相关指标检测，探讨囊胚玻璃化冷冻技术的长期安全性，为辅助生殖治疗的子代长期安全性提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料 （1）实验动物：SPF 级C57BL／6 雄鼠、雌鼠，ICR 雄、雌鼠由南通大学实验动物中心提供，实验动物生产许可证：SCXK（苏-2019-0001），实验动物使用许可证：SYXK（苏-2022-0046）。实验动物饲养于标准屏障环境实验设施内IVC 笼盒内，雄鼠单笼饲养，自由采食和饮水。（2）试剂：孕马血清促性腺激素（宁波第二激素厂），人绒毛膜促性腺激素（丽珠），蔗糖、DMSO、乙二醇、小鼠胚胎培养液、甲苯噻嗪（Sigma 公司），取卵-胚胎处理液、卵裂胚培养液、人血清白蛋白（Vitrolife），HE 染色试剂盒（上海生物工程有限公司），4%多聚甲醛（海门市碧云天生物科技公司）。

1.2 分组 选用4 周龄C57BL/6 小鼠超排合笼，收集3.5 d 囊胚，选取优质囊胚分为两组：（1）囊胚玻璃化冷冻保存，按标准方法[11]操作，4 周后复融移植到见栓后2.5 d 的ICR 代孕母鼠子宫；（2）新鲜囊胚移植，方法同冻融胚胎移植。囊胚玻璃化冷冻复苏移植出生小鼠为冻胚组，新鲜囊胚移植出生小鼠为鲜胚组，两组小鼠性成熟后与自然出生的C57BL/6 小鼠配对所生小鼠分别为冻胚子一代和鲜胚子一代。

1.3 观察指标

1.3.1 生长发育情况 各组小鼠自然分娩，记录仔鼠出生后满1～4 周龄体质量，观察仔鼠耳廓分离、上下牙萌出、睁眼、爬行、全身黑毛、阴道开口、睾丸下降等发育指标的达标时间。

1.3.2 生殖力测试 小鼠于出生后8 周，分别与自然出生的C57BL/6 小鼠配对，每组雌雄小鼠各6 只，统计窝仔数，检测生育能力。

1.3.3 行为学检测 选用10 周龄雄性小鼠，Morris水迷宫实验测试小鼠的学习记忆能力，转轮试验测试小鼠的平衡和运动协调功能，Crawley's 透明三箱测试盒检测小鼠的社交能力[12]。

1.3.4 形态学检查 生殖力检测结束后脱颈处死，取小鼠卵巢、睾丸组织，4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，HE 染色后拍照观察睾丸与卵巢的组织形态学变化。

1.4 统计学方法 采用GraphPad Prism8 统计软件分析处理数据，计量资料采用±s 表示，组间比较采用t 检验，计数资料以例数或百分率表示。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 体质量和发育指标 为避免因每窝产仔数过少或过多对小鼠发育指标的影响，本实验均选用每窝产仔数6～8 只的仔鼠，每组20 只，雌雄各10 只。分别于1～4 周龄每周测量体质量，结果发现冻胚组体质量在1 周龄和2 周龄时高于对照组（P＜0.05），3周龄后，冻胚组体质量虽然在数值上高于对照组，但差异无统计学意义（P＞0.05）；两组的子一代小鼠各时间点体质量差异均无统计学意义（均P＞0.05），与对照组相比差异亦无统计学意义（P＞0.05），见图1A。4组小鼠之间的各项发育指标差异均无统计学意义（均P＞0.05），见图1B。

图1 囊胚玻璃化冷冻后移植对小鼠及其子一代生长发育的影响

2.2 生殖力检测 雌鼠满8 周龄开始实验，与自然妊娠性成熟C57BL/6 雄鼠1∶1 合笼，历时16 周，至24 周龄结束实验。鲜胚组、冻胚组及两组的子一代雌鼠的妊娠率均为100%，实验阶段内各组怀孕窝数和每窝产仔数差异均无统计学意义（均P＞0.05）。雄鼠满8 周龄开始实验，与自然妊娠性成熟C57BL/6母鼠1∶2 合笼，次日起每日上午捡栓，将见栓母鼠分出，换入新母鼠，历时8 周，至16 周龄结束实验。每组交配母鼠数、生殖力（妊娠母鼠/交配母鼠）和每窝产仔数差异均无统计学意义（均P＞0.05），见表1。

表1 雌鼠、雄鼠生殖力检测

2.3 行为学检测 冻胚组及其子一代在连续4 d 的训练中，找到水迷宫站台时间和到达平台前的游行距离均逐日缩短，两项数据与鲜胚组相比差异均无统计学意义（均P＞0.05），在第5 天的测试中，到达平台前的游行距离与鲜胚组相比差异也无统计学意义（P＞0.05），见表2，说明冻胚组及子代小鼠具有良好的记忆能力。转轮试验测试小鼠平衡和运动协调功能，3 d的测试结果显示冻胚组及子一代在转轮速度和停留时间上与鲜胚组差异均无统计学意义（均P＞0.05），见图2A～B。基于小鼠喜群居、对新事物具有探索倾向的特性，使用“三箱社交测试”，通过记录受试鼠与同性陌生鼠或空笼接触时间来测试小鼠的社交行为。结果显示，冻胚组和鲜胚组及其子一代小鼠均表现为与陌生鼠的相处时间明显长于进入空笼室的时间（P＜0.05），说明本研究的实验条件及记录方式无误；在此条件下冻胚组与鲜胚组及其子代小鼠进入陌生鼠室或空笼室的时间相当（P＞0.05），见图2C。3 项行为学测试结果表明囊胚玻璃化冷冻对小鼠的学习记忆、平衡和运动协调功能以及社交能力没有明显影响。

表2 水迷宫实验检测小鼠到达水迷宫站台的时间及到达水迷宫站台前的游行距离

图2 囊胚玻璃化冷冻后移植对小鼠及其子一代平衡和运动协调功能及社交行为的影响

2.4 各器官形态学检查 囊胚玻璃化冷冻小鼠外观正常，小鼠体型和皮肤没有异常发现。小鼠于生殖力检测结束后处死（6 月龄）取心、肝、肾、卵巢、睾丸组织，均未发现明显异常（结果未显示）。进一步的组织学检查发现囊胚冷冻对小鼠及其子一代的生殖系统组织结构没有影响。如图3 所示，和鲜胚组相比，冻胚组的睾丸和卵巢的组织学形态及发育情况没有明显差别。

图3 囊胚玻璃化冷冻后移植对小鼠睾丸和卵巢组织学检查

3 讨论

因小鼠生长繁殖快，短时间内就可以观察到生命各阶段的生理特点，所以本研究选用了小鼠囊胚期胚胎来研究玻璃化冷冻的长期安全性，目前小鼠胚胎冷冻方法没有统一的操作标准。为了使小鼠胚胎玻璃化冷冻结果对临床有更好的参考价值，本研究采用了与人体胚胎冷冻完全一致的操作方法和试剂材料。

通过对囊胚冷冻复苏移植出生小鼠以及其子一代的生长发育指标检测发现，除囊胚玻璃化冷冻小鼠出生后1 周龄和2 周龄时体质量高于鲜胚组外，3周龄后与鲜胚组差距缩小并逐渐与对照组体质量相似，其他发育指标亦无异常，分析原因可能与胚胎玻璃化化冷冻技术本身有关。在ART 中，对胚胎玻璃化冷冻的临床结局研究[13]发现，冻胚移植后单胎妊娠中大于胎龄儿和高体质量儿发生率增高，支持玻璃化冷冻与出生体质量增加有关，但机制及可能的健康风险有待进一步研究。

随着辅助生殖技术试剂的商业化，胚胎体外培养效果明显改善并更加稳定[14]，延长胚胎体外培养到囊胚期再行移植可获得比卵裂期胚胎更好的临床妊娠率和活产率。因为通过延长体外培养时间，胚胎发育基因激活，具有发育潜能的胚胎得到优选而形成囊胚[15]。虽然各个发育阶段的胚胎均可冷冻保存，但囊胚是冷冻保存最有效的阶段[2]。囊胚移植对患者也是最有利的，因为囊胚与子宫内膜发育同步性好，植入率明显提高[16]，使选择性单胚胎移植成为可能。在降低双胎/多胎妊娠风险、保障母婴安全的辅助生殖治疗中，单囊胚移植已在临床广泛应用[17]。多余胚胎冷冻保存方法不断改进，玻璃化冷冻技术在近十多年来得到广泛应用，是一种超快速的胚胎冷冻保存方法。胚胎经高浓度冷冻保护剂处理后立刻投入液氮，在不到1 s 的时间内从37 ℃转变为-196 ℃，从而实现极快的冷却速度（＞10 000 ℃/min），胚胎在极短的时间内形成透明玻璃状结构，冷冻过程中没有冰晶形成，避免了冰晶对细胞结构的损伤[18]。但玻璃化冷冻使用的高浓度冷冻保护剂对子代的安全性值得关注，这也是本研究选择囊胚玻璃化冷冻复苏子代作为研究对象的原因。

囊胚玻璃化冷冻已经成为ART 治疗中的常规操作，对冷冻技术出生孩子的长期随访是必要的[10,19]。对玻璃化冷冻技术的安全性研究，目前从冷冻复苏率、种植率到对围生期和新生儿安全性各个阶段都有研究。研究[20]发现玻璃化冷冻明显提高胚胎复苏存活率、种植率、临床妊娠率和活产率，且不增加其他产科并发症，但新生儿体质量高于新鲜囊胚移植，而早产、小于胎龄儿和低出生体质量儿的风险明显降低。K.TAKAHASHI 等[21]对147 例冻胚移植出生的新生儿随访发现，囊胚玻璃化冷冻不影响妊娠时间和分娩方式，也不增加早产率和先天畸形发生率，认为囊胚玻璃化冷冻技术是安全的。但有关胚胎玻璃化后代的长期安全性的研究不多，且因子代没有大批进入生育年龄，缺乏玻璃化冷冻对子代生殖力影响的研究。本研究通过对小鼠囊胚期玻璃化冷冻复苏移植两代小鼠的长期观察，从出生早期的生长发育、成年后的行为学特征以及生殖力检测，探讨玻璃化冷冻对子代长期安全性的影响，结果显示囊胚玻璃化冷冻对小鼠和后代的学习记忆能力、社交活动、运动协调功能都没有影响，雌鼠在4 个月测试时间内妊娠次数和每窝产仔数没有明显改变，雄鼠在2个月测试期内的生育指数正常。囊胚玻璃化冷冻出生的小鼠和其子一代小鼠从幼年生长发育到成年期学习社交能力和生殖力不受影响，说明囊胚玻璃化冷冻是安全的。本研究结果为人类囊胚玻璃化冷冻的长期安全性提供了参考。

综上所述，小鼠囊胚玻璃化冷冻复苏技术对两代小鼠子的生长发育、行为学特征以及生殖力均未发现不良影响，因此囊胚玻璃化冷冻对小鼠子代是安全的。但本研究毕竟是动物模型的结果，囊胚玻璃化冷冻对人类胎儿、新生儿及成年期的安全性仍需长期随访。本研究也存在不足，在生殖力和行为学检测结束后未继续观察小鼠老年期的各项机能变化，对小鼠衰老、各种疾病的发生及寿命的影响尚不清楚，准备在后续的研究中加以完善，完成囊胚玻璃化冷冻2 代小鼠全生命周期观察。