三结构域蛋白21在肝细胞癌发生发展中的作用研究进展

陈颖综述 董卫国审校

原发性肝癌在世界范围内发病率与病死率居高不下,是全球第6大常见的癌症,也是癌症死亡的第3大原因[1]。在我国,原发性肝癌是第4位常见恶性肿瘤和第2位肿瘤致死病因[2]。肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是原发性肝癌中最多发的类型,占比高达75%～85%[1]。HCC的发病机制复杂、异质性大,肝炎病毒感染、酒精或非酒精性脂肪性肝病、黄曲霉毒素、遗传诱发因素等均与HCC发生发展密切相关。对于符合特定条件的患者,手术切除是最佳的治疗手段,但手术后也伴随着极大复发可能。鉴于疾病复杂性及个体差异化,目前临床推荐多学科参与,制订个体化的综合治疗方案[3]。

诸多研究表明,三结构域蛋白21(tripartite motif containing protein 21,TRIM21)与系统性红斑狼疮及干燥综合征等自身免疫性疾病相关,其在特异性与非特异性抗病毒感染中也发挥了关键性作用[4-5]。近年来,TRIM21在恶性肿瘤发生发展中的作用也备受重视。如TRIM21参与诸多恶性肿瘤的发生、增殖、凋亡、侵袭和转移过程,包括乳腺癌、鼻咽癌、肺癌、肾癌等[6-9]。现阶段的研究提示以TRIM21为靶点的治疗方式有望在癌症的临床实践中得以应用。近年来,研究发现TRIM21在HCC中也扮演着复杂且重要的角色,但目前国内尚无较全面的描述,故本文对TRIM21在HCC发生发展中作用的研究进展进行系统综述。

1 TRIM21的结构与功能

TRIM21属于TRIM家族的成员,编码该蛋白的基因位于11号染色体上,在细胞质和细胞核均有表达。TRIM21蛋白氨基端包含TRIM家族蛋白特征保守的RING、B-box和Coiled-coil结构域,其羧基端则为PRYSPRY结构域。RING结构域具有E3泛素连接酶活性[10];B-box(在TRIM21中为1个B-box2)结构域或能调节由RING介导的泛素化以及与其他蛋白质的相互作用[11];Coiled-coil结构域参与TRIM21同源二聚体的形成,进而促进RING结构域E3连接酶的底物识别与泛素化过程[12];PRYSPRY结构域能介导蛋白质及RNA的各种底物分子的识别[13]。蛋白质的泛素化修饰由酶促级联反应完成。泛素在ATP依赖性反应中被E1酶激活并在C末端与E1形成硫酯键,然后转移到E2酶的半胱氨酸活性位点上形成E2-Ub硫酯中间体。E3连接酶与E2-Ub硫酯和底物结合,催化泛素从E2的活性位点半胱氨酸转移到底物赖氨酸残基或N末端。RING结构域是真核生物中重要的E3泛素连接酶,泛素化的蛋白接着被引导入蛋白酶体并被降解,从而抑制蛋白的活性[14]。现有研究证实TRIM21发挥各种功能很大程度上基于其E3泛素连接酶活性。

2 TRIM21在HCC中的表达

2.1 表达增加 有学者在人类蛋白质图谱网站中对相关免疫组织化学图像进行比较,得出人类HCC组织TRIM21的蛋白质表达水平高于正常组织的结论[15]。类似的,通过TCGA数据库及人类蛋白质图谱数据库分析,结果显示HCC组织较正常肝组织TRIM21表达升高,差异有统计学意义。与正常人肝细胞系MIHA相比,TRIM21在Hep3B中表达增高[16]。Wang等[17]将49个 HCC 样本作为病例组,29个癌旁组织和20个肝血管瘤组织的队列作为对照,进行了TRIM21免疫组织化学染色,发现TRIM21蛋白水平在HCC组织中明显高于来自肝血管瘤或癌旁的非恶性肝组织。

2.2 表达减少 相反地,亦有研究通过基因表达数据库(gene expression omnibus,GEO)中的高通量数据,得出TRIM21在HCC组织中表达降低的结论[18]。相较正常人肝细胞系MIHA,TRIM21在HepG2、Huh7和SK-Hep-1中mRNA水平降低[16]。Ding 等[18]用免疫组织化学染色的方法检测了TRIM21在70个肝癌组织样本(61例HCC和9例胆管细胞癌)和10个非肿瘤性肝组织样本中的表达,发现正常肝组织中强阳性或中度阳性样本的百分比显著高于肿瘤组织。在人HCC细胞系SMMC7721、Huh7、Bel-7402、PLC、LM3、97L、97H中,TRIM21的蛋白表达低于正常肝细胞系L02。

HCC组织中TRIM21的表达水平是否较正常肝组织升高,不同的研究通过在线数据库分析、肝癌细胞系与临床样本收集检测的方式得出了不同的结论。基于数据库中的分析存在着不同的研究在不同时间节点选取不同的数据库进行进一步分析的差异。而收集临床样本进行检测的过程中也存在着纳入与排除标准不同,收集样本的数量、来源、人种、性别、分期等因素的差异。无论是收集到的在线数据库中的样本或临床收集样本都需要样本具有代表性才能更好地推论TRIM21在HCC总体中表达的变化情况。基础研究中针对肝癌细胞系与正常肝细胞系进行TRIM21表达量的检测也与细胞系的类型密切相关。

3 TRIM21差异表达与HCC的联系

在细胞和动物模型中进行TRIM21表达的敲除或者敲低,所引起的HCC调节也存在两个截然相反的效应。实验诱导产生的HCC模型中,TRIM21敲除小鼠相较野生型小鼠诱导模型,其肝损伤更严重并且产生了更多的癌结节[19]。实验性敲低97H及LM3细胞系中TRIM21的表达可增强HCC 细胞的体外侵袭能力;裸鼠尾静脉注射siTRIM21 LM3细胞可增强其肺转移能力[20]。此外,李涛等[21]通过siRNA干扰肝癌细胞系中TRIM21的表达,发现TRIM21表达降低可促进细胞的增殖。同样的,Ding 等[18]研究显示HepG2和LM3细胞中TRIM21的沉默可促进 HCC 细胞的增殖、集落形成、迁移和癌细胞抗凋亡。相反地,有研究提示小鼠TRIM21敲除可抑制二乙基亚硝胺/苯巴比妥诱导下的HCC发展[17]。

TRIM21表达水平的高低与HCC疾病进展及预后的关系在不同的研究中也未得到一致的结论。有研究认为TRIM21的mRNA表达水平与HCC的个体癌症分期和肿瘤恶性程度呈正相关。然而,进一步分析显示TRIM21的mRNA表达与HCC患者的预后相关性没有统计学意义[15]。而另有研究指出,TRIM21高表达患者较低表达患者预后更差[16]。另一项研究认为TRIM21的高表达与疾病进展及较差的总生存期呈正相关,但与无病生存期无关[22]。但是,Ding 等[18]的研究分析了GEO数据库的相关数据,结果提示TRIM21高表达肿瘤比TRIM21低表达肿瘤具有更佳的预后。研究证明抑制代偿性NRF2升高可增强双硫仑/Cu诱导的铁死亡对 HCC细胞的攻击,从而促进双硫仑/Cu和索拉非尼协同作用的细胞毒性[22]。Nrf2还受到Quiescin巯基氧化酶1抑制,协同增强索拉非尼诱导的铁死亡[23]。在HepG2细胞系中的研究表明,P62表达水平的上调与肝癌细胞对索拉非尼的敏感性降低有关[24]。由此猜测,TRIM21对P62-Keap1-Nrf2途径的抑制作用可能增强索拉非尼治疗的敏感性。此外,明确HCC中TRIM21差异表达有助于TRIM21在HCC诊断中的应用。Wang等[17]比较了TRIM21与临床常用的HCC生物标志物甲胎蛋白的诊断能力,发现在受试者工作特征曲线中,TRIM21的曲线下面积(AUC=0.798)高于甲胎蛋白(AUC=0.756)。有趣的是,TRIM21基因多态性也与HCC相关,并可用于评估HCC患者的远处转移。Lee等[25]分析了来自1 196例正常对照组和394例HCC患者的TRIM21基因的两个单核苷酸多态性:rs4144331和re915956,发现拥有TRIM21 rs915956 A等位基因的年轻患者(<65岁)和有吸烟史且携带rs4144331的T等位基因的患者患HCC的风险均增加。

TRIM21参与 HCC 发生发展的多个环节,明确TRIM21在HCC发生发展中的作用机制对HCC临床诊断、治疗、预后判断有潜在的价值,甚至可发现HCC治疗的新靶点,进而补充现有治疗方案。

4 TRIM21在HCC中的作用机制

4.1 p62-Keap1-Nrf2途径 有研究报道TRIM21利用其泛素E3连接酶活性调节p62-Kelch样ECH相关蛋白1(Kelch like-ECH-associated protein 1,Keap1)-核因子红系2相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)途径,从而促进HCC发生。体内外实验均证明TRIM21敲除可防止氧化性肝损伤从而减少HCC的发生发展[17]。

Nrf2在维持细胞内稳态以适应性地响应外源化合物和氧化应激中占据着重要的角色[26]。处于稳态时,Keap1与细胞质中的Nrf2相互作用并促进Keap1依赖的泛素化,继而使Nrf2在蛋白酶体中被降解而维持在较低水平,即Keap1是Nrf2的负调节因子。在氧化应激情况下,Keap1对Nrf2的抑制作用主要受到经典与非经典途径的负调控,Nrf2较稳态时表达增加[27]。(1)经典途径:Keap1的半胱氨酸残基被氧化并诱导其构象变化,这种蛋白修饰阻止Keap1对Nrf2的泛素化,更多的Nrf2转移到细胞核中。(2)非经典途径:SQSTM1/p62(简称p62)具有ETGE基序的蛋白质,磷酸化的p62与Keap1亲和力增高,竞争Keap1-Nrf2结合,从而阻断Keap1依赖的Nrf2泛素化。Nrf2正调节p62基因表达,构成正反馈环路。通过上述途径,更多的Nrf2发生核易位并与抗氧化反应原件(antioxidant response element,ARE)结合,激活抗氧化反应相关基因的转录[28]。TRIM21在蛋白质毒性应激和氧化应激诱导下利用其PRYSPRY结构域直接与p62相互作用并通过K63键在赖氨酸K7处泛素化p62,进而阻碍p62的寡聚化及与Keap1的结合,抑制p62-Keap1-Nrf2抗氧化应激途径[29],从而增加细胞氧化损伤并诱发HCC。

最近的研究已经确定了Nrf2的许多功能,超出了其氧化还原调节能力,其中就包括其在癌症发生发展中的复杂作用[30]。p62的缺失促进了L-Atg5/Tsc1双基因敲除鼠中肝脏肿瘤的进展。Nrf2敲除能够加强肝细胞的增殖,改善双基因敲除小鼠的代谢重编程和存活,而不会形成肿瘤[31]。在二乙基亚硝胺诱导的大鼠肝癌模型中,在HCC发展过程中Nrf2靶向基因的表达逐渐增加,Nrf2同Keap1与肌动蛋白细胞骨架的相互作用在HCC结节内被破坏[32]。有研究表明,TRIM21和p62之间的关联可被升高的RPRD1A竞争性地中断,随后抑制p62的泛素化,稳定Nrf2,进一步促进HCC的进展[33]。一项在大鼠中的研究提示Nrf2在肝癌发生的早期会发生突变或者激活,这在后续肝癌的进展中发挥关键作用[34]。

与氧化应激反应类似,p62-Keap1-Nrf2抗氧化途径在HCC发生发展中的作用复杂,与具体病理生理环境相关,是一把双刃剑,同时在疾病的不同阶段有不同的促癌机制[35]。基于p62-Keap1-Nrf2抗氧化途径多样的调节效应,以及HCC发病机制的高度复杂性与异质性,需要更多的相关研究来明确TRIM21利用该途径对HCC发挥的作用。

4.2 抗HBV途径 乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染是HCC的重要危险因素。TRIM21能够抑制病毒的复制,从而减少由病毒性肝炎发展而来的HCC。HBV病毒DNA复制过程中,TRIM21可结合HBx蛋白发挥其E3泛素连接酶活性使得相关蛋白降解,从而抑制病毒复制与HCC发生发展[36]。HBx是由HBV DNA开放阅读框X编码的一种调节蛋白,是通过蛋白质间相互作用控制细胞和病毒的启动子和增强子来驱动HBV病毒感染的关键。此外,HBx还在HCC中扮演重要角色,通过调节HCC标志物以维持增殖信号转导,逃避生长抑制,促进免疫逃逸和永生性复制,辅助参与肿瘤引发的炎性反应,触发侵袭和转移,促进血管生成,诱导基因组不稳定,防止细胞凋亡和扰乱细胞能量代谢来影响下游细胞机制[37]。HBV感染早期,特异性抗体尚未形成,TRIM21可以与HBx直接结合,促进HBx降解[36]。特异性抗体形成之后,抗体包被病毒并进入细胞质,TRIM21的PRYSPRY结构域结合抗体的Fc段,从而介导HBx蛋白质降解[38]。除了泛素化降解HBx蛋白之外,有研究表明TRIM21可以结合HBV DNA聚合酶并参与泛素化降解,进一步抑制病毒复制活性[39]。

综上所述,TRIM21通过介导HBV复制所需的HBx蛋白以及HBV DNA聚合酶的泛素化降解以抑制HBV的复制。同时,HBx在HCC进程中发挥多种多样的作用,促进HCC发生发展。TRIM21通过抗HBV途径对HCC起到抑癌因子的作用。

4.3 其他途径 HCC的危险因素众多,发病机制复杂,TRIM21在其他通路中泛素化降解相关蛋白,从而发挥调节作用。Wang等[40]报道,胰腺祖细胞分化和增殖因子与RIPK1相互作用,通过募集TRIM21促进了RIPK1 k63相关的泛素化,促进了RIPK1和NF-κB信号的激活,从而抑制HCC。一项研究利用免疫共沉淀测定表明TRIM21能够与β-连环蛋白相互结合,TRIM21通过促进β-连环蛋白的泛素化和降解来抑制β-连环蛋白的核易位,继而抑制HCC细胞的侵袭[20]。另一项研究提示乙酰辅酶A乙酰转移酶1 (acetyl-CoA acetyltransferase 1,ACAT1)使甘油磷酸-O-酰基转移酶(glyceronephosphate O-acyltransferase,GNPAT)在K128位点乙酰化,抑制TRIM21介导的GNPAT泛素化和降解。更多稳定的GNPAT加速抑制TRIM21介导的脂肪酸合酶(fatty acid synthase,FASN)降解并促进脂质代谢[41]。实验证明,shRNA介导的ACAT1消融和GNPAT乙酰化缺失可抑制裸鼠异种移植和二乙基亚硝胺/四氯化碳诱导的小鼠HCC中的脂质代谢和肿瘤进展。此外,联合ACAT1抑制剂与索拉非尼给药可显著延缓小鼠肿瘤的形成[41]。类似地,李涛等[21]认为TRIM21通过下调自噬相关蛋白4B(autophagy-related protein 4B,ATG4B)影响细胞周期,进而抑制HCC细胞增殖。

5 小结与展望

TRIM21具有泛素连接酶E3活性,参与蛋白质泛素化降解,影响蛋白生物活性,从而发挥复杂的调节作用。在不同的研究中,HCC中TRIM21的表达水平无统一结论,但更多的研究认为HCC中TRIM21表达增加。这可能与不同研究之间所检索的在线数据库以及纳入研究的病例数和患者特征存在差异有关。增加病例数,根据患者特征进行分组分析与合理设置对照或能得出信度与效度更高的结论。TRIM21对HCC调控结果也存在争议。TRIM21通过对p62-Keap1-Nrf2途径负调节以对抗氧化应激反应,但氧化应激本身在癌症中就拥有着双面效应,在导致HCC中,TRIM21通过此途径引发相反的调节作用。此外,TRIM21能够加速HBx和HBV DNA聚合酶降解,抑制HBV复制与发挥其他抗HCC作用。β-连环蛋白、ATG4B、GNPAT和FASN等在HCC发生发展中发挥重要作用的蛋白质的泛素化也由TRIM21介导,最终抑制HCC发生发展。HCC的发病机制复杂,患者间异质性大,TRIM21在不同病因导致的HCC及不同阶段有不同的表现,这可能是导致结论不一致的重要因素。TRIM21与HCC 之间关系错综复杂,想要清晰描绘TRIM21在HCC中的作用网络并应用于临床需要展开更多更全面而深入的研究。