卵胞浆内单精子注射技术的精子优选方法

范宇平，胡烨，滕晓明

辅助生殖技术发展至今，已成为解决人类生育问题的重要手段，其包含和衍生出的各种技术也随着辅助生殖技术本身的进步而日新月异。现在卵胞浆内单精子注射技术（ICSI）日益成熟，对于男性而言配子的问题是最受关注的，也关乎辅助生殖的各个环节[1]。ICSI 中精子优选技术的应用对ICSI 结局的各个指标存在影响，如何合理选择精子优选技术是各生殖中心如何提高胚胎质量的重要课题。

1 常规精子优选方法

常规精子优选是指采用人工方法去除精浆、死亡或在镜下明确畸形的精子及其他有害物质，选择活动力强，形态学相对更好的精子，并使精子在体外获能。所谓常规，即在辅助生殖技术精液处理过程中会常规应用，主要包括了上游法和密度梯度离心（DGC）。

上游法是将精液和培养液共同孵育，使活动能力好的精子游到上层培养液中。该方法可除去精浆及精浆内抑制受精的物质，达到体外获能。其优点在于操作简便、成本低廉及不良反应少，并可获得更高的颗粒大小和更低DNA 碎片率的精子[2]。但前向运动精子总数少、黏稠或不液化的精液使上游法回收率低，故不适宜通过上游法处理，因为精子必须克服重力和其他阻力向上游动。虽然上游法可回收质量较高的精子，但一般回收率相对较低[3]。上游法的回收率依赖于精子细胞团表面积和精子的活动力，受精液本身的质量和精浆中细胞碎片及白细胞的影响。

DGC 是将不同梯度的分离液和精液分层加入，经离心得到沉淀，然后定容于培养液中，通常该方法用于前向运动精子总数较少的精液。有研究认为，常规参数异常的精子经DGC处理后，得到优选精子的顶体反应率、低渗肿胀试验阳性率和核成熟的精子比例均优于上游法[4]，经DNA 碎片率检测发现，DGC 处理后的精子DNA 完整性明显高于经上游法处理的精子[5]，因而建议选择DGC 对质量较差的精子进行优选。DGC 的优点是处理精液后的精子回收率较高，处理时间较短，但对比上游法，DGC 成本略高，且离心操作可能对精子存在一定损伤，因而一般推荐用于前向运动精子明显少的精液。

2 不动精子的优选

当ICSI 精液处理时发现，精液中全部或绝大多数是不活动精子，例如精子鞭毛多发形态异常（MMAF）或者纤毛不动综合征这样的极端情况，上游法无法实现精子优选，DGC 也不能确定获得存活的精子。对于这样的情况，应选择更有效的精子优选方式以获得活精子。

低渗透肿胀试验是ICSI 前判断精子是否存活的最古老也是最简便的方法，由此判断不动精子是否存活。由于过程简单、成本低，低渗肿胀试验的临床应用十分广泛，其有效性也可以明确，但低渗肿胀试验处理后的精子ICSI 的操作时会比较困难，且低渗肿胀试验后待精子恢复原样再行ICSI 需要等待较长时间。

激光辅助不动精子优选的方法是在ICSI 之前高倍视野下选择形态较好的不动精子，在靠近精子尾部尖端处用激光点射，活精子在激光刺激后精子尾部会立即出现卷曲或折角的现象。激光导致精子尾部卷曲的机制尚不清楚，可能与激光照射后介质流入精子尾部有关[6-7]。由于激光点射部位在精子尾部尖端，尽量远离精子DNA 区域，因而推断不会对精子DNA 造成损害。有研究认为此方法可以有效鉴别极重度弱精子的存活情况，这些存活的极重度弱精子通过ICSI 可以达到与正常精子基本相同的受精率，而且有助于提高卵裂率和优质胚胎率[7]。但也有研究显示激光辅助不动精子优选后的ICSI 与传统相比，虽然能够提高受精率，但囊胚形成率、质量和利用率均有下降[8]。因为必要性和安全性的争议，目前激光辅助精子优选在临床开展相对较少。

3 精子形态的分选

形态选择单精子注射（IMSI）是基于活精子细胞器形态学检测的技术，其利用倒置显微镜结合数码放大的原理，可将放大倍数提高到6 300 倍，甚至有报道其可放大倍数提高到13 000 倍[9]，从而可以观察到精子的超微结构，并依据精子形态学快速检查标准，对精子顶体、顶体后致密层、颈部、尾部、线粒体和精子核6 个部分进行形态学观察，选择符合正常形态标准的精子进行ICSI。但IMSI 的临床价值尚存争议[10-11]，首先IMSI 的形态学观察具有一定主观性，各文献报道差异较大；其次，即便可以优选形态正常的精子，也并不能排除DNA损伤的精子，因此有的研究认为其对ICSI 的结局并没有改善[12]。目前共识认为，对于圆头精子症等特殊类型的畸形精子症，IMSI配合卵母细胞激活可以提高ICSI 成功率[13]。

评价精子质量还应考虑精子细胞质的异常。细胞质成熟的精子细胞核具有固有的双折射，因而有了偏振光显微镜优选精子的方法。精子头部的双折射可以作为反映其细胞核正常结构组织的指标。双折射也可以评估顶体反应的状态，因为细胞质成熟的精子在整个头部出现双折射，而发生顶体反应的精子仅在顶体后区存在双折射[14]。精子头部的双折射模式与精子活力和正常形态之间有一定的相关性，形态异常或活力差的精子具有异常双折射模式，且形态与双折射特性的关联性更强[15]。偏振光显微镜精子优选是一种无创的物理优选手段，但其过程耗时长，目前临床应用尚不多。

4 精子功能的优选

精子功能的优选方式中，由透明带穿透试验而来的透明质酸结合试验临床常见。该方法是在普通的Petri 皿上增加4 个固定的透明质酸点，并在该点的周围滴加洗涤过的精子，经培养结合15 min 后，成熟的精子便会结合在透明质酸点上，而其他不成熟精子不会结合到该点而是自由游动。行ICSI 时只要选取结合在透明质酸点上的精子即可[16]。由于透明质酸是宫颈黏液和卵泡液的组分，因此透明质酸结合法能保证安全性。也有研究显示，通过透明质酸结合试验优选的精子，其正常形态率、核蛋白成熟度显著增高，DNA碎片率显著降低[17]，在严重畸形精子症ICSI 中受精率和胚胎质量也有显著提高[18]，是目前临床相对开展较多的精子功能优选方法。

膜联蛋白V选择法是一种较为常用的磁珠活性细胞分选技术，即将膜联蛋白V 偶联在微小的磁珠上，将精子混悬液同磁珠混悬液孵育，凋亡的精子就会吸附在磁珠上，将此混合液通过具有磁性的分选柱，吸附凋亡精子的磁珠便会吸附在分选柱上，而未凋亡的精子则会自由通过。精子凋亡的标志包括线粒体跨膜电位破坏、caspase-3 激活、磷脂酰丝氨酸外翻及DNA 碎片率升高等。研究显示，这些指标都是受精失败的相关因素[19-20]。但由于膜联蛋白Ⅴ选择法无法筛选去除白细胞及未成熟的精子，故需与DGC 联合使用。这一方法也可用于对冷冻后精子筛除凋亡精子的优选[21]。研究显示，与传统ICSI 相比，经膜联蛋白V选择法的患者受精胚胎质量、着床率、临床妊娠和持续妊娠率等均无统计学意义，仅在年龄＜30 岁的分组中，膜联蛋白Ⅴ选择法的优质囊胚率、临床妊娠率、持续妊娠率更高[22-23]，其临床价值亦不确定。证据表明，电泳法对精子活力存在负面影响，且使用负电位的机制优选精子对精子总数要求相对较高，并存在出生性别比的争议[22]。

综上所述，从目前临床数据看，基于形态学和精子功能的精子优选技术有理论上的价值，但对于ICSI 的临床结局的改善没有明确的证据。目前还有一些新的精子优选技术，如微流体分离以及使用芯片技术的方法，方法越来越多，且不断在革新。因为没有具有垄断优势的技术，临床值得思考的是如何选择合适的方法去解决实际问题。

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