观赏海棠品种间的杂交亲和性研究和亲本选择

魏子秋,彭 冶,李丰霞,狄昌毅,张往祥*

(1 南京林业大学 林学院,南京 210037;2 南京林业大学 生物与环境院,南京 210037)

观赏海棠(Malusspp.)主要包括蔷薇科(Rosaceae)苹果属(Malus)中果径 ≤ 5 cm的一类植物[1]。观赏海棠在中国有悠久的栽培历史,被广泛应用于园林绿化中,是集观花、观果、观叶、观形为一体的优良观赏植物。苹果属植物大多存在自交不亲和现象,这是植物避免自交衰退,促使异交产生杂种,增强后代活力,促进物种的遗传多样性的重要遗传机制[2]。观赏海棠属于配子体自交不亲和类型,受具有复等位基因的S基因位点的控制[3],因此观赏海棠的种质创新主要依赖于开放授粉选育和少量的非定向杂交育种。中国具有丰富的海棠原种资源,与此不匹配的是,观赏海棠的新品种选育工作起步较晚,早期主要依赖于欧美进口。近年来,国内观赏海棠育种工作受到重视,江苏省扬州市的国家海棠种质基因库通过引进,自主选育,海棠原种和品种十分丰富。目前,全世界人工培育的观赏海棠栽培品种已达1 000多个[4]。大部分观赏海棠的品种是通过实生选择培育获得,亲缘关系较复杂,尤其父本来源及其性状特征不明确,增加了优质新品种的培育周期。

目前,关于海棠的生殖特性和育种方面的研究仍然集中于报道不同品种的花粉活力[5-6]、花粉贮藏特性[7]以及品种间授粉方式对坐果和果实品质的影响[8-9]等方面,但有关海棠花粉育性的等级评价、柱头可授性、最佳可授时期、授粉后花粉管的生长及受精时间的确定,花粉育性与柱头可授性对杂交亲和性的影响,以及品种间杂交后的坐果率动态分析等鲜见报道。明确观赏海棠的生殖特性,探明其杂交亲和性的强弱,有利于新品种的人工定向选育,提高育种效率。

本研究选择15个具不同观赏特性的海棠品种,主要研究了花粉育性、柱头可授性、授粉后的花粉管行为及坐果规律,以期为观赏海棠培育筛选出优良亲本,并确定最佳的授粉时间和杂交组合,为海棠园圃品种配置,后续新品种培育过程中优质亲本的选择和控制授粉等工作的开展提供依据。

1 材料和方法

1.1 试验地概况与试验材料

试验地位于江苏省扬州市江都区仙女镇(32°25′39″N,119°33′20″E)的国家海棠种质基因库,年平均气温约14.9 ℃,年均降雨量约1 000 mm,无霜期约320 d;试验地地势平坦,土壤肥沃,灌排条件良好。试验材料为15个观赏海棠品种,树龄12～15年,生长状况良好。供试海棠品种名称及主要观赏特性见表1。

1.2 试验方法

1.2.1 花粉活力和花粉含量测定

2022年3月底开始,于各品种盛花期的晴天上午8:00采集处于气球期的花蕾。花粉活力测定参照赵纪伟等[10]的方法并略作修改,培养基为:蔗糖100 g/L+硼酸200 mg/L+硝酸钙400 mg/L,pH 5.8,培养时间改为4 h。单花药花粉含量测定方法参照杜洋文等[11]的方法,每个品种观察10滴悬浮液,设3次重复。花药的花粉量(粒/花药)=每滴悬浮液中平均花粉粒数×1000/10。

1.2.2 柱头可授性测定

采用联苯胺-过氧化氢法测定各品种花期内(开花前1 d至开花第6天)的柱头可授性。每个品种每天随机采集开放程度一致的3朵花,将柱头取下浸泡在联苯胺-过氧化氢溶液中1 min后用Olympus BX-51显微镜拍照,设3次重复。

根据柱头产生的气泡直径大小进行相应赋值(图1),气泡直径0～50 μm赋值为1;50～100 μm为2;100～150 μm为3;150～200 μm为4;>200 μm为5。统计开花不同时期的每个柱头产生各直径气泡的数量,计算出得分。

A～G. 分别为开花第0～6天的柱头。图1 ‘金丰收’柱头可授性A-G. The stigmas on the 0 to 6th day of flowering.Fig.1 Stigma receptivity of M. ‘Harvest Gold’

1.2.3 控制授粉及坐果率统计

选择‘芭蕾舞’ב凯尔斯’、‘凯尔斯’ב芭蕾舞’、‘红玉’ב龙游路易莎’、‘冬红’ב印第安之夏’,‘草莓果冻’ב印第安之夏’5个杂交组合。在各母本盛花期,选出开花前1 d的花蕾,每个花序仅留中心花,做好挂牌标记,分别进行以下不同处理:(1)去雄、套袋:选取50朵花去雄、套袋,检测无融合生殖能力;(2)人工杂交授粉:选取50朵花去雄、套袋,第2天进行人工授粉。授粉后15 d统计初始坐果率,至果实成熟期每隔15 d统计1次各处理的坐果数。

1.2.4 授粉后花粉管行为的荧光显微观察

在上述杂交组合授粉后4,8,12,24,48,72,96,120,144 h,每个时期至少采集3个母本的雌蕊,用 FAA固定液(70%酒精∶冰醋酸∶38%甲醛=90∶5∶5)于4 ℃冰箱内保存。参照薛志霞等[12]的方法处理雌蕊,在Nikon Eclipse 50i荧光显微镜紫外光波段下观察杂交后花粉管在柱头和花柱中的行为并进行拍照,设3次重复。

1.3 数据处理

利用IBM SPSS 26对花粉萌发率和花粉量,柱头可授性数据进行方差分析,分别对父本花粉萌发率和母本柱头可授性与结实指标间进行相关性分析;利用Origin 2021绘制柱头可授性柱状图和坐果率点线图。

2 结果与分析

2.1 15个海棠品种的花粉育性评价

试验结果表明,多数品种的花粉萌发率和花药花粉含量有显著差异(表2)。15个海棠品种的花粉萌发率均值为54.34%,萌发率最高是‘时光秀’为88.98%;花粉量最高的品种是‘高原玫瑰’,达24 380粒/花药,而‘草莓果冻’的成熟花药中未观察到花粉。依据花粉萌发率,可将供试品种划为4类:

表2 15个海棠品种花粉萌发率和花药含粉量

(1)雄性不育型,特征是花粉萌发率10%以下,花粉量极少或无,包括‘火鸟’、‘春之韵’和‘草莓果冻’3个品种,均不适宜作为父本。

(2)雄性育性较低型,特征是花粉萌发率10.1%～40%,花粉量低,仅有‘芭蕾舞’1个品种。

(3)雄性育性中等型,特征是花粉萌发率40.1%～70%,包括花粉量极高的‘白兰地’和中等的‘红玉’等5个品种。

(4)雄性育性优质型,特征是花粉萌发率70.1%以上,包括‘时光秀’、‘印第安之夏’、‘冬红’等6个品种,但它们的花粉量差异显著,花粉萌发率高,可为优质父本,占供试品种的40%。

2.2 15个海棠品种花期不同阶段的柱头可授性差异分析

从检测结果(图2)来看,所有品种在开花前1 d(第0天)的柱头可授性最低,均在30以下,且与其他时期达到极显著差异(P<0.01);开花第3天时的柱头可授性最强,在35～61之间,与其他时期也达极显著差异(P<0.01),而开花的第2～4天内大都能维持在较高水平。

邓肯法多重比较,不同大、小写字母分别表示同一品种不同开花时期1%、5%水平下的差异显著性。图2 15个海棠品种的柱头可授性P value of significance was estimated by Duncan’s, different capital and normal letters represent different flowering periods of the same cultivar’s significant difference at 1% and 5% levels, respectively.Fig.2 Stigma receptivity of 15 crabapple cultivars

从数据来看,‘草莓果冻’、‘白兰地’的柱头可授性各时期均优于其他品种,是优质母本;而‘冬红’的柱头可授性峰值虽较高,但持续时间仅1 d,应注意把握授粉时机。

从大蕾到末花阶段,各品种柱头可授性均呈现“弱—强—弱”的规律性变化。开花前1 d柱头可授性极低,可能与柱头表面细胞的生理功能尚未成熟有关,到第3天其柱头接受并促使花粉萌发的生理功能才完全成熟;而花粉活力测定试验发现,花粉在大蕾期已完全成熟,开花当天花药即开裂,花粉完全散出,这暗示了同花的花粉在同柱头萌发的可能性极低,推测海棠可能通过雌雄异熟避免自交,以进一步保证异交成功。

2.3 授粉后花粉管生长动态变化荧光观察

授粉4 h后,柱头分泌层细胞排列紧密,乳突之间的间隙较小。各母本柱头仅粘附极少量花粉,除‘红玉’外,其他母本柱头均有少量花粉萌发。其中,‘草莓果冻’柱头上的花粉管穿过柱头,其他母本柱头的花粉管在柱头表面尚未进入(图3,A1-E1)。授粉后8 h,柱头花粉粘附量和萌发量增多,‘红玉’柱头花粉开始萌发,但在柱头表面未进入;其他母本柱头的花粉管穿过柱头向下生长,长度在500 μm以内(图3,A2-E2)。

A.‘芭蕾舞’; B. ‘凯尔斯’; C. ‘红玉’; D. ‘冬红’; E. ‘草莓果冻’,箭头为花粉管到达处,下同。1-4、6、8分别为授粉后4,8,12,24,48,72 h的柱头,5、7、9、10分别为授粉后24,48,72,96 h的花柱,A11-D11、A12-D12分别为授粉后72,96 h的子房,E11、E12为授粉后48,72 h的子房。1-10.200×, 标尺为100 μm; 11-12.40×, 标尺为500 μm。图3 授粉后雌蕊局部花粉管生长的荧光显微观察A. ‘Ballet’; B. ‘Kelsey’; C. ‘Red Jade’; D. ‘Winter Red’; E. ‘Strawberry Jelly’. The arrow is the place where the pollen tube arrives, the same below. 1-4, 6, 8 were stigmas at 4, 8, 12, 24, 48, 72 h after pollination; 5, 7, 9, 10 were styles at 24, 48, 72, 96 h after pollination, respectively, A11-D11 and A12-D12 were ovaries at 72, 96 h after pollination, E11 and E12 were ovaries at 48, 72 h after pollination, respectively. 1-10.200×, bar is 100 μm; 11-12. 40×, bar is 500 μm.Fig.3 Fluorescence microscopic observation on the growth of local pollen tubes in pistils after pollination

授粉后12 h,柱头分泌细胞间隙逐渐增大,‘芭蕾舞’、‘凯尔斯’、‘草莓果冻’柱头花粉大量萌发,花粉管中有胼胝质填充(图3,A3-E3)。授粉24 h后,柱头分泌层的细胞排列疏松,‘红玉’、‘冬红’柱头的花粉也大量萌发(图3,C4-D4),‘芭蕾舞’、‘凯尔斯’、‘红玉’、‘冬红’、‘草莓果冻’中的花粉管分别到达花柱的1/5、1/3、1/6、1/4、1/3处(图4,A1-D1,图3,A5-E5)。授粉48 h后,‘芭蕾舞’、‘凯尔斯’、‘红玉’、‘冬红’花柱中花粉管到达花柱1/2,3/5、1/2、1/3处,‘草莓果冻’中少量花粉管已穿过花柱基部(图4,A2-E2;图3,A7-E7),到达子房室上方,但尚未进入胚珠(图3,E11)。授粉72 h后,‘草莓果冻’的胚珠已有数条花粉管穿过(图3,E12),其余母本中均有少量花粉管到达花粉管基部,但除‘冬红’子房室上方有少量花粉管外,均未见花粉管(图3,A11-D11)。

1-4.分别为授粉后24, 48, 72, 96 h的花柱。图4 授粉后花柱中花粉管生长的荧光显微观察1-4. The styles were 24, 48, 72, 96 h after pollination, respectively. 40×, bar is 500 μm.Fig.4 Fluorescence microscopic observation on the growth of pollen tubes in styles after pollination

授粉96 h后,各母本花柱基部的花粉管数量明显增多(图3,A10-E10),且均有花粉管进入胚珠(图3,A12-D12)。结果表明‘草莓果冻’ב印第安之夏’完成受精的时间为48～72 h,其余4个组合完成受精的时间为72～96 h,各组合均不存在明显的受精前障碍。

2.4 授粉后坐果动态变化的比较分析

由5个月的坐果率统计结果来看,5个母本中只有‘草莓果冻’存在无融合生殖现象,无融合生殖率为80%(图5,A),低于杂交的92%(图5,B)。且荧光观察发现,‘草莓果冻’能完成有性生殖,为兼性无融合生殖类型。5个杂交组合中,‘冬红’ב印第安之夏’,‘草莓果冻’ב印第安之夏’的初始坐果率均超过90%,前者更达98%,且‘冬红’的坐果率较稳定,最终仍达88%(图5,B)。各杂交组合坐果后的1.5个月(授粉后2个月)内是落果集中期,之后除‘红玉’外,坐果率较稳定,仅陆续有少量落果(图5,B)。

图5 控制授粉下的坐果数动态变化Fig.5 Dynamic changes of fruit setting number under controlled pollination

根据花粉活力和柱头可授性检测的结果结合坐果率的动态变化看,‘冬红’为优质杂交亲本,其花粉育性及柱头可授性均较高,是雌雄育性均优质的品种,其与‘印第安之夏’杂交后坐果率高,单果种子数也远高于其他组合(表3),种子饱满率达70.03%,亲和性最高。‘红玉’ב龙游路易莎’初始坐果率虽较高,但其存在2次落果高峰期,最终坐果率、单果种子数、种子饱满率也不高(图5,B和表3),亲和性一般。‘芭蕾舞’ב凯尔斯’的正反交坐果率及单果种子数、种子饱满率等结实指标均较低(图5,B和表3),且‘凯尔斯’的果实2.5个月后已完全掉落。而荧光观察表明两组合能够完成受精,表明杂交不亲和是受精后障碍所致。

表3 各杂交组合的结实情况

相关性分析(表4)表明,父本的花粉萌发率与初始坐果率、种子饱满率间存在极显著正相关性(P<0.01),与最终坐果率间存在显著正相关性(P<0.05);柱头可授性与初始坐果率、最终坐果率、种子饱满率间均存在显著正相关性(P<0.05);坐果率与种子饱满率之间存在极显著正相关性(P<0.01)。柱头可授性与结实指标间的相关性不及花粉萌发率,原因可能是结实主要受果实发育影响,而不仅取决于柱头可授性,而花粉活力则影响精细胞能否进入胚珠与卵细胞进行受精。

表4 杂交亲本与结实指标间的相关性分析

3 讨 论

花粉是被子植物的雄配子体,生殖细胞分裂在花粉粒或花粉管中进行[13]。花粉正常发育是为被子植物能够完成有性生殖的重要前提,花粉活力是衡量植物雄性育性的重要指标。花粉小粒、瘪粒和畸形是导致萌发率较低的主要原因[14]。孙寰等[15]依据I2-KI染色率将大豆花粉育性分为不育(败育率95.1%以上)、可育(败育率0～10%)、半不育(败育率10.1%～95%)和典型半不育(败育率40.1%～60%)4类;Raj等[16]和贺和初[17]也分别将水稻花粉育性划分为4类,只是划分标准略有不同。然而,在苹果属植物中的雄性育性评价的研究却鲜见报道。实际上,选择雄性育性优质的品种作为授粉树对海棠观果品种的观赏价值、新品种的培育及提高苹果的经济价值,均具有重要意义。本研究根据花粉活力对供试海棠品种的雄性育性进行等级评价,将15个海棠品种分为雄性不育型、雄性育性较低型、雄性育性中等型、雄性育性优质型4类。赵红霞等[18]在进行现代月季杂交研究中发现花粉生活力对杂交亲和性有显著影响,与杂交结实率呈正相关。本研究依据杂交结果进行的相关性分析也显示花粉育性与杂交坐果率、种子饱满率间均具有极显著的正相关性,即雄性育性优质的品种作为父本,坐果率和种子饱满率均较高。而花粉活力高、花粉量大的品种也有利于减少工作量,提高育种效率,适宜作为授粉树推广。本研究的荧光观察表明,花粉活力高的‘印第安之夏’作为父本时,花粉管到达胚珠的时间短,数量多,有利于完成受精。因此,本研究筛选出的‘印第安之夏’、‘时光秀’、‘冬红’等6个雄性优质品种可作为优质父本。

柱头发育成熟是植物可以进行有性生殖繁育的前提,成熟柱头能够承接、黏附、识别花粉。因此,柱头可授性的强弱及其持续时间对杂交成功与否有重要影响。湿柱头释放的分泌物中含有糖类、硼、Ca2+、氨基酸、各种酶类等[19],有利于花粉黏附、水合,并为花粉萌发提供必需的营养。当柱头表面分泌物较多时,有利于花粉完成水合、萌发、向下生长,因此柱头可授性较强。前人利用联苯胺-过氧化氢法进行柱头可授性研究时,多仅通过观察柱头产生气泡多少、颜色深浅进行定性评价[20-21]。本研究利用开花不同时期柱头在相同时间内产生气泡的大小和数量进行定量分析,相关性分析结果显示,柱头可授性与初始坐果率、最终坐果率、种子饱满率间均存在显著正相关性,表明此方法能更精准直观地反映出柱头可授性的强弱变化规律。研究结果发现海棠的柱头可授性呈现“弱—强—弱”的变化趋势,原因是开花前1 d柱头的生理功能尚未完全成熟,柱头分泌物较少,不利于花粉萌发;随着花朵开放,第3天时柱头完全发育成熟,分泌物增多,有利于花粉水合、萌发,因此为最佳可授期;此后柱头逐渐衰老,可授性又逐渐降低。而从花粉活力测定及田间观察可知,花粉在大蕾期已成熟,开花当天即完全散出,并且能够培养萌发,这种雌雄异熟的现象在樟科、胡桃科植物较为常见[22-23],但海棠有关方面的研究鲜见报道,这可能是海棠避免同花自交,保障异交以维持后代遗传多样性的一个重要机制。王丽敏等[24]发现荔枝的柱头可授性也存在着“弱—强—弱”的规律;唐英等[25]的研究也发现大花黄牡丹柱头花前1 d柱头可授性较低,开花后3～4 d达到最高,可授性可维持12 d。因此以往在大蕾期去雄,次日即进行授粉的方法并不适用于所有植物。在海棠的杂交工作中,应在开花前1 d去雄套袋,3 d后再进行授粉有利于提高育种效率。

柱头与花粉识别后,不亲和的花粉管顶端被胼胝质堆积膨大停止生长,亲和的花粉管中胼胝质规则分布[26]。柱头分泌物中的过氧化物酶能通过疏松柱头分泌细胞的细胞壁,增大细胞间隙,促使花粉管穿过柱头进入花柱的输导组织[27]。花粉管进入花柱后通过输导组织向下生长,精细胞在花粉管顶端随花粉管到达子房,进入胚囊完成双受精。花粉在柱头上的萌发率和及花粉管到达子房的时间及数量反映了杂交亲和性的高低。本研究荧光观察发现授粉4 h的海棠柱头花粉粘附量和萌发量极低,而8 h后明显增多,表明海棠花粉与柱头充分完成水合需8 h。但此时柱头分泌细胞排列紧密,不利于花粉管向下生长。授粉24 h后,柱头分泌细胞间隙增大,排列疏松,有利于花粉管生长速度加快。‘草莓果冻’和‘冬红’的柱头花粉均大量萌发,进入子房的花粉管也较多,‘草莓果冻’完成受精的时间最早,表明‘印第安之夏’为父本,‘草莓果冻’和‘冬红’为母本亲和性较高。Sharafi等[28]的研究表明不同苹果品种间的杂交,花粉管在授粉72 h能够进入子房,授粉120 h后到达子房的花粉管数量又增加了近1倍。薛志霞等[12]的研究指出红富士异花授粉8 h花粉开始萌发,24～48 h花粉管穿过花柱1/2,48～120 h花粉管继续生长到达子房室,与本研究基本相符。

坐果率高低是植物杂交亲和性高低的最直观的表征指标。苹果属多倍体种类多具有较强的兼性无融合生殖能力,而二倍体一般不具有[29]。本研究中‘草莓果冻’无融合生殖率低于杂交坐果率,且杂交后花粉管能进入胚珠,表明其为兼性无融合生殖,而其倍性有待鉴定。相关性分析表明,花粉活力和柱头可授性与坐果率、种子饱满率间均存在显著的正相关性,因此优先选择育性优质的亲本是杂交工作取得成功的关键。各杂交组合授粉后2个月内是落果集中期,可能是存在不同程度的胚胎发育障碍造成的,属于受精后障碍。彭琴等[30]的研究指出‘凯尔斯’海棠在授粉后1～54 d是海棠胚胎败育发生的主要时期,授粉后1～13 d后的大量落果可能与果实中的GA3的含量急剧下降,CTK含量升高有关,其落果时期与本研究的‘凯尔斯’基本一致。陈瑞丹等[31]的研究也表明赤霉素处理柱头和幼果对梅花品种间的杂交中后期落果有较好的抑制作用。授粉后2个月为海棠果实的胚发育障碍的主要发生期,后续可利用石蜡切片、内源激素水平测定对落果较多的品种的胚发育过程进行观察测定,确定胚发育异常的具体时期及原因,通过激素处理提高坐果率、胚挽救等措施适时进行胚培养,获得杂交后代。

通过对海棠品种的雄性育性的评定、柱头可授性规律的探究、授粉后花粉荧光观察及坐果率变化规律及影响因素的分析等方面研究,对观赏海棠品种间杂交亲和性的综合评价,授粉时期的确定,海棠的种质创新与园圃的品种配置等方面具有重要意义。本研究筛选出了‘印第安之夏’、‘冬红’等6个海棠品种为优质父本,确定了开花第3天为海棠最佳授粉期,可授性能维持3 d;发现了海棠花粉与柱头的功能发育存在不同步,推测其雌雄异熟;授粉后2个月内为海棠果实的胚发育关键期,本研究中的海棠杂交不亲和的主要原因是受精后障碍。‘冬红’的雌雄育性均为优质,‘冬红’ב印第安之夏’、‘草莓果冻’ב印第安之夏’为高坐果率杂交组合,后续可对其杂交后代的主要观赏性状进行观测,以期筛选出具有优良性状的新品种,为海棠新品种的定向培育提供参考依据。