欧洲鳗鲡寄生鳗鲡肤孢虫的超微结构和组织病理特征

李梦晴,李丹,柳阳

(青岛农业大学海洋科学与工程学院,山东青岛 266109)

肤孢虫(Dermocystidium)隶属于新单胞菌门(Neomonada),中黏菌纲(Mesomycetozoea),肤孢目(Dermocystida),是一类寄生海水和淡水鱼类的原生动物寄生虫[1-3]。肤孢虫的生活史不需要中间宿主,发育过程包括孢囊阶段、孢子阶段和单鞭毛动孢子阶段[4-5]。变形体细胞在孢囊内发育成孢子,成熟孢子被释放到水体中,孢子在水体中继续发育并形成大量单鞭毛动孢子,单鞭毛动孢子侵染宿主[4-6]。肤孢虫主要寄生在鱼类的鳃、皮肤、鳍条等部位,在寄生部位形成卵圆形、哑铃形或香肠状的孢囊,并造成机械损伤,出现充血、增生、发炎、溃烂等现象,严重时可导致宿主大量死亡[1,6-7]。

鳗鲡肤孢虫(DermocystidiumanguillaeSpangenberg, 1975)寄生于欧洲鳗鲡(AnguillaanguillaLinnaeus, 1758)的鳃,先后在日本、英国、匈牙利等国家被发现和报道[1,8-9]。近年来,我国养殖的美洲鳗鲡(AnguillarostrataLesueur, 1817)和欧洲鳗鲡发生了由肤孢虫引起的寄生虫病害。Liu等[10]和Li等[11]根据形态特征和分子序列比较,鉴定寄生于我国养殖的美洲鳗鲡和欧洲鳗鲡的肤孢虫为鳗鲡肤孢虫,首次报道该寄生虫病原在我国的分布,美洲鳗鲡是鳗鲡肤孢虫的新宿主记录。为追溯我国鳗鲡肤孢虫病原的来源,Li等[11]建立了鳗鲡肤孢虫的特异性分子检测方法,并在进口的美洲鳗鲡苗种(玻璃鳗)中检测到了鳗鲡肤孢虫,推测我国的鳗鲡肤孢虫病原是由进口的美洲鳗鲡苗种携带进入我国的。鳗鲡肤孢虫已成为我国美洲鳗鲡和欧洲鳗鲡养殖的重要寄生虫病原。

目前,鳗鲡肤孢虫孢囊和孢子的显微特征已被完整地描述[1,9],但超微结构的相关研究较少。欧洲鳗鲡和美洲鳗鲡的鳃是鳗鲡肤孢虫的靶器官,但是鳗鲡肤孢虫对鳃组织的病理损伤仍不清楚。为了完善鳗鲡肤孢虫形态学和组织病理学信息,本研究从欧洲鳗鲡的鳃分离鳗鲡肤孢虫,进行扫描电镜和透射电镜观察,并研究了鳗鲡肤孢虫对宿主鳃组织的病理损伤。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

间氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐(MS-222),100 mg/L,上海希格玛高技术有限公司;戊二醛,体积分数2.5%,乙酸异戊酯,柠檬酸铅(AR),上海麦克林生化科技有限公司;多聚甲醛,体积分数4%,广州硕谱生物科技有限公司;磷酸盐缓冲液(PBS),伊红染液,北京索莱宝科技有限公司;锇酸溶液,质量分数1%,上海易佰聚经贸有限公司;无水乙醇,国药集团化学试剂有限公司;醋酸铀,广东方信生物科技有限公司;二甲苯,天津市富宇精细化工有限公司;苏木精染液,武汉赛维尔生物科技有限公司。

临界点干燥仪,上海默津仪器设备有限公司;离子溅射仪,深圳市速普仪器有限公司;HITACHI SU8010扫描电镜,株式会社日立制作所;Leica UC7超薄切片机,自动切片机,德国徕卡公司;TECNAI G2 20 TWIN透射电镜,美国FEI公司;ZEISS AXIOCAM 105 COLOR显微镜,蔡司集团。

1.2 样品来源、采集与保存

32尾欧洲鳗鲡采自福建省福州市的一个养殖场(26°08′N,119°28′E),体长为7.8～15.3 cm,体质量为0.3～4.6 g。充氧后,将欧洲鳗鲡运回青岛农业大学海洋科学与工程学院水生动物寄生虫学实验室暂养。使用MS-222将欧洲鳗鲡麻醉,分离并保存鳗鲡肤孢虫孢囊以及宿主鳃组织。鳗鲡肤孢虫的孢囊分别用体积分数2.5%的戊二醛和体积分数4%的多聚甲醛固定。

1.3 扫描电镜观察

根据孙洁等[12]的方法,用体积分数2.5%的戊二醛4 ℃固定孢囊24 h,然后用0.1 mol/L PBS清洗3次。用质量分数1%的锇酸溶液4 ℃避光固定孢囊3 h,然后用0.1 mol/L PBS清洗3次。梯度乙醇脱水后,放入乙酸异戊酯中置换3次,每次20 min。用临界点干燥仪干燥,用离子溅射仪镀膜,最后使用扫描电镜观察孢子表面超微结构。

1.4 透射电镜观察

根据孙洁等[12]的方法,将孢囊用体积分数2.5%的戊二醛4 ℃固定24 h,然后用0.1 mol/L PBS清洗3次。用质量分数1%的锇酸溶液4 ℃避光固定3 h,然后用0.1 mol/L PBS清洗3次。梯度乙醇脱水后,放入渗透剂中37 ℃渗透10 h。利用环氧树脂包埋,60 ℃恒温水浴聚合48 h。使用超薄切片机进行切片,切片厚度为80 nm。先后使用醋酸铀和柠檬酸铅对切片进行染色,过夜,干燥。使用透射电镜观察孢子超微结构。

1.5 组织病理学观察

根据刘志科等[13]的方法,用体积分数4%的多聚甲醛溶液固定鳃组织24 h,梯度乙醇脱水后,使用二甲苯对脱水后的组织进行透明处理,然后进行浸蜡和包埋。利用自动切片机切片,切片厚度8 μm。利用二甲苯对切片进行脱蜡,然后使用苏木精染液进行初染,再使用伊红染液进行复染。中性树胶封片后,使用显微镜观察鳃组织的病理特征。

2 结果描述

2.1 临床症状

鳗鲡肤孢虫寄生于欧洲鳗鲡的鳃,在鳃部形成大量白色孢囊,导致鳃部凸起,鳃盖呈透明状(图1)。

图1 患鳗鲡肤孢虫病的欧洲鳗鲡

2.2 孢子表面超微结构

鳗鲡肤孢虫孢子呈球形,大小均一,大部分孢子处于同一发育时期,个别孢子处于二分裂阶段(图2A)。孢子表面粗糙,被一层网状物质包裹,孢子之间通过网状物质连接(图2B)。部分孢子分裂时形成的芽痕突起清晰可见(图2C),突起部位具有多个不规则的凹陷(图2D),孢子另一端无突起和凹陷。

A. 鳗鲡肤孢虫孢子(白色虚线方框指示处于二分裂阶段的孢子,×1 500);B. 被网状物质包裹的孢子(×10 000);C. 孢子分裂时形成的芽痕突起(箭头指示芽痕,×10 000);D. 孢子芽痕上的不规则凹陷(箭头指示凹陷,×40 000)。

2.3 孢子内部超微结构

孢子外侧有一层电子疏松的孢子壁。孢子中可见一个大而圆的遮光体,占据了孢子内部大部分空间(图3A)。细胞核和核仁清晰可见,液泡、脂质空泡等细胞器位于遮光体的一侧(图3B)。

A. 鳗鲡肤孢虫孢子内的遮光体(×6 000);B. 鳗鲡肤孢虫孢子内的细胞器(×6 000);

2.4 组织病理变化

未感染鳗鲡肤孢虫的欧洲鳗鲡鳃组织,结构完整,鳃小片排列整齐,如图4A所示。感染鳗鲡肤孢虫的欧洲鳗鲡鳃组织,鳗鲡肤孢虫寄生于宿主鳃丝,挤压周围鳃组织,导致鳃组织结构变形,无法判断孢囊准确的寄生部位(图4B)。鳗鲡肤孢虫的寄生导致宿主鳃丝融合,鳃小片脱落,观察不到鳃丝的正常结构(图4C)。孢囊具有一层嗜酸性孢囊壁,同时孢囊周围可见明显的炎性细胞浸润(图4D)。

A. 未感染鳗鲡肤孢虫的欧洲鳗鲡鳃组织(×4);B. 感染鳗鲡肤孢虫的欧洲鳗鲡鳃组织(p处为鳗鲡肤孢虫孢囊,×4);C. 感染鳗鲡肤孢虫的欧洲鳗鲡鳃组织(p处为鳗鲡肤孢虫孢囊,×7);D. 鳗鲡肤孢虫孢囊(箭头指示孢囊壁,p处为鳗鲡肤孢虫孢囊,×40)。

3 讨论

目前,全世界共记录19种肤孢虫,其中6种分布在我国[10,14],分别是寄生于异育银鲫(CarassiusgibelioBloch, 1782)皮肤的中华肤孢虫(DermocystidiumsinensisXiao et Chen, 1993)[2],寄生于斑鳢(ChannamaculataLacepède, 1801)鳃的广东肤孢虫(DermocystidiumkwantungensisChen et Xie, 1960)[15],寄生于河鲈(PercafluviatilisLinnaeus, 1758)皮肤的鲈肤孢虫(DermocystidiumpercaeReichenbach-Klinke, 1950)[14],寄生于鲤(CyprinuscarpioLinnaeus, 1758)皮肤和肌肉组织的野鲤肤孢虫(DermocystidiumkoiHoshina et Sahara, 1950)[16],寄生于翘嘴鳜(SinipercachuatsiBasilewsky, 1855)鳍条、皮肤、口腔和鳃的鳜肤孢虫(DermocystidiumsinipercaeZhang et Gu, 2022)[14],以及寄生于欧洲鳗鲡和美洲鳗鲡鳃的鳗鲡肤孢虫[10-11]。其中,鳗鲡肤孢虫是我国欧洲鳗鲡和美洲鳗鲡养殖的重要寄生虫病原[10-11]。为完善鳗鲡肤孢虫形态学和组织病理学信息,本研究对其超微结构和组织病理特征进行了补充描述。

本研究通过扫描电镜观察发现,鳗鲡肤孢虫孢囊内的孢子呈球形,大小均一。张波等[14]发现鳜肤孢虫孢囊内的孢子大小一致。然而,Fujimoto等[17]发现一种肤孢虫未定种(Dermocystidiumsp.)的孢囊内充满大小不同的孢子。鳗鲡肤孢虫孢囊内的大部分孢子处于同一发育时期,个别孢子处于二分裂阶段。张波等[14]在对鳜肤孢虫的孢子进行观察时也发现少量处于二分裂阶段的孢子,说明肤孢虫孢囊内的孢子不是同步发育的。Hassan等[18]在阿拉伯肤孢虫(DermocystidiumarabicaHassan, Osman, Mahmoud, 2014)的孢囊中观察到菌丝状结构,部分孢子附着在菌丝上,但是本研究在鳗鲡肤孢虫孢囊中未观察到这种结构。鳗鲡肤孢虫的孢子被一层网状物质包裹,孢子之间通过网状物质连接。这种网状物质在鲑肤孢虫(DermocystidiumsalmonisDavis, 1947)和一种肤孢虫未定种(Dermocystidiumsp.)孢子表面也能观察到[17,19],但是该网状物质的成分和具体功能仍不清楚。然而,阿拉伯肤孢虫和鳜肤孢虫的孢子表面光滑[14,18],说明这种网状物质并非存在于所有肤孢虫孢子的表面。

本研究利用透射电镜在鳗鲡肤孢虫的孢子中观察到遮光体、细胞核、核仁、液泡、脂质空泡等结构。Olson等[4]在鲑肤孢虫孢子中观察到了遮光体、细胞核和线粒体。张波等[14]在鳜肤孢虫孢子中仅观察到遮光体。由于切片角度不同,不同学者在肤孢虫孢子中观察到不同种类的细胞器。张波等[14]在鳜肤孢虫孢子中观察到单鞭毛动孢子,但是Langenmayer等[19]及本研究作者均未在肤孢虫孢子内观察到单鞭毛动孢子,这可能是因为观察的肤孢虫孢子所处的发育时期不同。遮光体是肤孢虫孢子重要的结构特征[20]。Liu等[10]系统发育分析发现,寄生于林蛙(RanaesculentaLinnaeus, 1785)的AmphibiocystidiumranaePascolini, Daszak, Cunningham, Fagotti, Tei, Vagnetti, Bucci, Rosa, 2003与肤孢虫聚为一支。但是,Pascolini等[21]在A.ranae的孢子中未观察到遮光体,说明A.ranae与肤孢虫存在较大的结构差异,A.ranae与肤孢虫的系统发育关系有待进一步研究。

本研究通过组织病理分析发现,鳗鲡肤孢虫寄生于欧洲鳗鲡的鳃丝中,由于孢囊挤压导致宿主鳃组织严重变形,无法确定鳗鲡肤孢虫具体的寄生部位。Wootten等[9]通过组织病理分析推测鳗鲡肤孢虫的孢囊可能起源于宿主鳃丝基部。鲑肤孢虫寄生于大鳞大马哈鱼(OncorhynchustshawytschaWalbaum, 1792)的皮肤和鳃,Olson等[22]发现鲑肤孢虫寄生引起宿主鳃小片脱落、鳃丝呈棒状,并指出,呼吸表面积的明显减少导致大鳞大马哈鱼幼鱼大量死亡。鳗鲡肤孢虫寄生欧洲鳗鲡鳃,也导致宿主鳃丝融合、鳃小片脱落,但并未造成宿主大量死亡[1,9]。学者推测,欧洲鳗鲡可能通过皮肤组织补偿了被破坏鳃组织的呼吸功能[1,9]。学者发现,寄生于鮈杜父鱼(CottusgobioLinnaeus, 1758)和淡黑杜父鱼(CottuscaeruleomentumKinziger, Raesly et Neely, 2000)皮肤的两种肤孢虫未定种(Dermocystidiumsp.)未引起宿主的炎症反应,仅当孢囊破裂时,宿主才发生强烈的炎症反应[23-24]。然而,本研究在鳗鲡肤孢虫孢囊周围观察到明显的炎性细胞浸润,说明即使孢囊未破裂,鳗鲡肤孢虫也能引起宿主的免疫反应。Wootten等[9]、Molnár等[1]在寄生鳗鲡肤孢虫的欧洲鳗鲡鳃组织中也观察到了类似的炎症反应。