基于肠道菌群和短链脂肪酸代谢探讨不同饮食条件下高脂血症大鼠发病机制

杨宗统孙铁锋*李晓晶徐东川袁敏靳光乾王雯慧*

（1. 甘肃农业大学动物医学院，兰州 730070；2. 山东省中医药研究院，济南 250014）

高脂血症（hyperlipidemia，HLP）是一种常见的代谢紊乱性疾病，由于脂肪代谢紊乱而造成血浆脂质失衡［1］，临床上主要表现为血液中总胆固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、低密度脂蛋白胆固醇（low density lipoprotein-cholesterol，LDL-C）水平升高或高密度脂蛋白胆固醇（high density lipoprotein-cholesterol，HDL-C）水平降低。 这种血脂异常会增加多种疾病发生的潜在风险，如心脑血管疾病［2］、脂肪肝［3］和动脉粥样硬化［4］等。 目前人们生活质量大大提高，生活方式也发生了很大的变化，生活节奏加快以及不健康的饮食方式等导致了高脂血症的发生率逐渐增加，年轻趋势明显，已日益凸显为影响健康的重要因素［5］。

研究表明疾病的发生和发展过程受肠道菌群和宿主代谢表型改变的影响［6］。 肠道微生态具有参与食物消化吸收、营养与物质代谢过程，增强宿主的免疫等功能，可影响高脂血症、肥胖及其相关代谢性疾病的发生和发展过程［7-8］。 禁食和热量限制会降低肠道菌群的总量及多样性，改变肠道菌群数目，有利于宿主代谢健康［9］。 短链脂肪酸（shortchain fatty acids，SCFA）和肠道微生物代谢直接相关，可为宿主代谢提供能量，是维持机体健康的重要信息介质［10］。 在肠道中发挥着维持水和电解质平衡、调节肠道菌群平衡、改善肠道功能、抗炎、抗肿瘤和调控基因表达等重要作用［11］。 短链脂肪酸大多数产生在盲肠和近端结肠，肠道菌群可通过代谢产物短链脂肪酸来影响脂代谢，因此现代研究提出肠道微生态与机体健康密切相关，肠道菌群可能是高脂血症防治的新靶点［12-15］。

制备高效、合理、稳定的高脂血症动物模型以及探讨实验中高脂血症的发病机制对于预防和治疗高脂血症至关重要。 目前国内外研究中最常见建立方法是高脂饲喂法，即通过高脂膳食诱导在饮食方面进行干预，该方法的形成机制与大多数高脂血症患者的高血脂病因和发病机制相似，但是在实验中发现长期的高脂膳食导致大鼠的食欲下降、摄食量不足以及进食个体差异较大，从而造成模型不稳定，降低了模型制备的效率［16-17］。 因此，本研究中采用高脂饲料限制饲喂和不限量饲喂的两种喂养方式建立高脂血症大鼠模型，基于肠道菌群变化与短链脂肪酸代谢特征分析从宿主-肠道菌群-代谢角度探讨高脂血症可能的微观机制，以期为高脂血症发病机制的研究提供新方向；并对两种高脂饲喂方式建立的模型大鼠血清生化指标、肝病理、肠道菌群及短链脂肪酸的变化进行比较分析，以期为降脂药物的研发建立一种新的动物模型制备方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

30 只5 周龄SPF 级SD 大鼠，雌雄各半，体重150 ～200 g，购于济南朋悦实验动物繁育有限公司【SCXK（鲁）20190003】。 饲养期间各组大鼠自由饮水，维持饲料（含蛋白质23.76%，粗纤维5%，脂肪3.5%），高脂饲料（含蛋白质26%，粗纤维8%，脂肪21.5%）。 室温22 ～25℃，相对湿度50% ～60%，每12 h 明暗交替的环境中，饲养于山东省食品药品检验研究院动物实验室【SYXK（鲁）2018-0013】。本动物实验经山东省中医药研究院实验动物福利与伦理委员会批准（SDZYY20210106001），且严格按照替代、减少和优化的“3R”原则。

1.1.2 主要试剂与仪器

BCA 蛋白浓度测定试剂盒（ Sparkjade，EC0001）； 苏木素-伊红（ HE） 染色试剂盒（Sparkjade，EE0012）；戊巴比妥钠（上海化学试剂采供供应站分装厂，120505）； T-CHO 测试盒（20220110）、TG 测试盒（20220111）、HDL-C 测试盒（20220110）、LDL-C 测试盒（20220110）均购自南京建成生物工程研究所；磁珠法提取试剂盒（Qiagen，Valencia，California，USA）；Phusion ® High-Fidelity PCR Master Mix with CG Buffer （ New England Biolabs，M0531S）； Phusion ® High-Fidelity DNA polymerase（New England Biolabs，M0530S）；DNA 纯化回收试剂盒（TianGen，DP214）；建库试剂盒（IIIumina，E7370L）。 乙酸乙酯（Sigma，CG-MS 级，240370）； 乙酸（Sigma，A6283）； 丙酸（ Sigma，402907）；丁酸（Sigma，B103500）；异丁酸（Sigma，I1754）； 戊酸（Sigma，240370）； 异戊酸（Sigma，129542）；己酸（Sigma，153745）。

高速冷冻离心机（VELOCITY 18R；Dynamica，德国）；微孔板分光光度计（EPOCH；BioTek，美国）；电子天平（BSA224S-C；Wsartorius，德国）；封闭式自动组织脱水机（Excelsior AS；ThermoFisher Scientific，美国）；组织包埋机（HistoStar；ThermoFisher Scientific，美国）；轮转式切片机（531CM-Y43；Leica，德国）；Bio-rad T100 梯度PCR 仪（T100；Bio-Rad，美国）；基因测序仪（Novaseq 6000；IIIumina，美国）；气-质联用仪（Agilent 7890A/5975C；Agilent，美国）；色谱柱（Agilent DB-WAX；Agilent，美国）毛细管柱30 m ×0.25 mm ID × 0.25 μm。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及模型制备

30 只SD 大鼠，雌雄各半，适应性喂养大鼠维持饲料3 d，禁食不禁水12 h 后称定体重，根据体重随机分成3 组：正常饮食组（CG 组）、高脂饮食组（HFD1 组）、限饲高脂饮食组（HFD2 组），每组10只。 CG 组：每天不限量饲喂维持饲料；HFD1 组：每天不限量饲喂高脂饲料；HFD2 组：每天定量饲喂高脂饲料80 g，高脂饲料吃完后不限量饲喂维持饲料。为了验证大鼠高脂血症模型是否成功建立，观察模型建立后继续饲喂高脂饲料对各项检测指标的影响，4 周后分别测定各组大鼠血清TC、TG、LDL-C、HDL-C 水平，与正常对照组相比，血清TG 或TC 或LDL-C 升高，差异具有显著性，判定模型成立；高脂饲料持续饲喂8 周。

1.2.2 样本采集及处理

（1）血清样本：分别于高脂饲料喂养的第4 周和第8 周取血，每次取血前禁食12 h，第4 周采用眼眶后静脉丛采血法取血；第8 周采用戊巴比妥钠麻醉后，腹主动脉取血。 得到全血样品之后，室温下静置30 min 之后，4℃3000 r/min 离心10 min 收集上清液，-20℃保存备用。 （2）脂肪和肝组织：大鼠腹主动脉取血处死后解剖取肾周脂肪和肝，用镊子夹住肝门部门静脉根部剪断血管和韧带取出肝，分离左外叶，将大鼠肾与肾门周围脂肪组织一并摘出，分离左肾周围棕黄色脂肪组织，分离后的组织置于4%多聚甲醛溶液中固定。 （3）肠道内容物：用无菌解剖刀，在无菌状态下取出整个肠道；在无菌操作台内切取结肠部位，用无菌手术刀挖取内容物，立即放在冰上进行分装并标记；分装好后立即进行液氮速冻，置于-80℃保存。

1.2.3 大鼠体重、摄食量及血脂检测

每天观察大鼠一般状态（毛色、活动量、排便、死亡情况等），每周称量并记录大鼠体重1 次，每天称量并计算各笼大鼠的饲料摄食量，计算各笼的平均摄食量。 依照试剂盒说明书方法检测第4 周和第8 周各组大鼠血清TG、TC、LDL-C 和HDL-C 含量。

1.2.4 大鼠肝、脂肪组织形态学观察

大鼠肝和脂肪组织进行苏木精-伊红（HE）染色，光镜下观察其形态学变化。

1.2.5 大鼠肠道内容物16S rDNA 扩增子测序

采用CTAB 方法从结肠内容物中提取总DNA，并对DNA 的纯度和浓度进行检测。 16S rDNA 扩增子测序（16S rDNA amplicon sequencing），检测各组大鼠肠道菌群变化情况。

1.2.6 大鼠肠道内容物短链脂肪酸检测

基于气相色谱-质谱联用（CG-MS）技术检测各组大鼠肠道内容物菌群关键代谢产物短链脂肪酸含量。

1.3 统计学分析

所有数据以平均值± 标准差（±s）表示，采用SPSS 21.0 和GraphPad Prism 9.0 统计学软件进行统计分析，组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 高脂饮食对大鼠体重、摄食量及血脂水平的影响

各组大鼠皮毛光泽度好，正常进食饮水和排便，活动自如，无死亡现象。 由图1 可知，各组大鼠体重均有不同程度变化，饲喂高脂饲料3 周后HFD1 组和HFD2 组的大鼠体重均高于CG 组，6 周后HFD2 组的大鼠体重显著高于CG 组（P＜0.01）。 各组大鼠的摄食量也存在不同程度变化，饲喂高脂饲料4 周后，HFD1 组和HFD2 组大鼠的摄食量均低于CG 组，且HFD1 组大鼠的摄食量低于HFD2 组（图1B）。 分析高脂饮食对大鼠体重和摄食量影响的结果发现，长期饲喂高脂饲料影响大鼠食欲，降低了大鼠的摄食量，每天限量饲喂高脂饲料可以减轻高脂饲料对大鼠食欲的影响，增加体重增长速度。

注：A：高脂饮食对大鼠体重的影响；B：高脂饮食对大鼠摄食量的影响；与CG 组相比，*P ＜0.05，**P ＜0.01。 （下图/表同）图1 高脂饮食对大鼠体重和摄食量的影响（x¯±s，n ＝8）Note. A. Effect of high-fat diet on the body mass of rats. B. Effect of high-fat diet on food intake of rats. Compared with CG group，*P ＜0.05，**P ＜0.01. （The same in the following figures and tables）Figure 1 Effects of high-fat diet on body weight and food intake of rats（x¯±s，n ＝8）

检测第4、8 周各组大鼠血清TG、TC、LDL-C 和HDL-C 含量，与CG 组相比，第4 周HFD1 组和HFD2 组大鼠血清中TC、TG 均显著升高（P＜0.05，P＜0.01），两组大鼠血清LDL-C 均显著升高（P＜0.01），HFD1 组HDL-C 水平显著降低（P＜0.05）；第8 周HFD1 组和HFD2 组大鼠血清中TC、TG 和LDL-C 均显著升高（P＜0.01），HDL-C 水平显著降低（P＜0.01），结果显示改变高脂饮食方式均引起大鼠体内血脂代谢紊乱，发生高脂血症（表1）。

表1 高脂饮食对肥胖大鼠血脂水平的影响（±s，n ＝8）Table 1 Effects of high-fat diet on blood lipids in obese rats（±s，n ＝8）

表1 高脂饮食对肥胖大鼠血脂水平的影响（±s，n ＝8）Table 1 Effects of high-fat diet on blood lipids in obese rats（±s，n ＝8）

组别Groups时间Time总胆固醇（mmol/L）TC（mmol/L）甘油三酯（mmol/L）TG（mmol/L）高密度脂蛋白（mmol/L）HDL-C（mmol/L）低密度脂蛋白（mmol/L）LDL-C（mmol/L）CG HFD1 HFD2 4 周4 weeks 2.249 ± 0.0540.967 ± 0.0501.288 ± 0.1780.486 ± 0.079 2.690 ± 0.103*1.321 ± 0.063*0.810 ± 0.139*1.088 ± 0.039**3.458 ± 0.218**1.410 ± 0.135**1.214 ± 0.1551.096 ± 0.073**CG HFD1 HFD2 8 周8 weeks 2.271 ± 0.1080.765 ± 0.0351.785 ± 0.1990.708 ± 0.055 3.638 ± 0.304**1.470 ± 0.204**0.655 ± 0.150**1.348 ± 0.146**4.160 ± 0.224**1.542 ± 0.145**0.762 ± 0.163**1.372 ± 0.182**

2.2 高脂饮食对大鼠肝和脂肪组织形态学的影响

剖检各组大鼠肝组织发现CG 组肝表面光滑呈暗褐色，质地柔软；HFD1 组颜色微黄，出现黑褐色点斑，HFD2 组整个肝颜色较黄，边缘圆钝。 肝HE染色表明，CG 组肝小叶中肝细胞排列正常，肝小叶结构清晰，肝细胞板呈放射状排列，未见细胞变性和炎细胞浸润；HFD1 和HFD2 组肝小叶均出现脂肪变性，肝脂滴较多，可见明显气球样变（见图2），HFD2 组出现肝索排列紊乱，部分肝细胞破裂，肝小叶结构模糊（见图2）。 肾周脂肪HE 染色表明，CG组肾周脂肪组织细胞排列紧密，大小均匀；HFD1 组和HFD2 组脂肪组织细胞大小不均，少量细胞胞质断裂，脂滴空泡融合，脂肪细胞有损伤（见图3），HFD2 组脂肪组织多灶状炎细胞浸润（见图3）。

图2 高脂饮食对大鼠肝组织的影响Figure 2 Effect of high-fat diet on liver tissue of rats

图3 高脂饮食对大鼠肾周脂肪组织的影响Figure 3 Effect of high-fat diet on perirenal adipose tissue in rats

2.3 高脂饮食对肠道菌群多样性的影响

收集各组新鲜粪便，采用16S rDNA 测序方法分析菌群多样性。 主坐标分析（principal coordinates analysis，PcoA）用于分析样本群落组成的相似性或相异性，是一种非约束性的数据降维分析方法。 对测序数据进行Alpha 多样性分析，绘制大鼠肠道菌群的Chao1 指数、Simpson 指数、Shannon指数、Observed species 指数箱线图，可以看出高脂饲料喂养后，α 多样性降低，但无统计学意义（P＞0.05）（见图4A）。 本次实验各组间PcoA 分析显示HFD1 组与HFD2 组和CG 组在主坐标1（PC1）上相距较远，说明HFD1 组和HFD2 组与CG 组间菌群组成有差异；HFD1 组与HFD2 组重合度较高，说明HFD1 组与HFD2 组菌群组成相似（见图4B）。 韦恩图显示了CG、HFD 和HFD2 各组之间的ASV 分布。 3 个组共有的ASV 有665 个，HFD 物种数量较CG 组物种数量有所减少（见图4C）。 在门分类水平上，共挑选出丰度前10 的菌门，由图可知厚壁菌门（p__Firmicutes）、变形菌门（p__Proteobacteria）、放线杆菌门（p__Actinobacteria）、疣微菌门（p__Verrucomicrobia）、拟杆菌门（p__Bacteroidetes）、蓝菌门（p__Cyanobacteria ）、 酸杆菌门 （ p__Acidobacteria）、 芽 单 胞 菌 门 （p__Gemmatimonadetes）、绿弯菌门（p__Chloroflexi）是优势菌门（见图4D）。 在属分类水平上，共挑选出丰度前10 的菌属，由图可知，乳杆菌属（g__Lactobacillus）、罗尔斯通菌属（g__Ralstonia）、罗姆布茨菌属（g__Romboutsia）、埃希氏菌属（g__Escherichia-Shigella）、 梭 杆 菌 属 （g__Clostridiumsensustricto1）、 苏黎世杆菌属（g__Turicibacter）、链球菌属（g__Streptococcus）、罗斯氏菌属（g__Rothia）、阿克曼菌属（g__Akkermansia）是优势菌属（见图4E）。

注：A：各组样本菌群α 多样性分析；B：各组样本菌群PcoA 分析；C：ASV 维恩图；D：门水平上的肠道微生物群组成；E：属水平上的肠道微生物群组成。图4 高脂饮食对大鼠肠道菌群的影响（n ＝6）Note. A. Analysis of α diversity of microflora in each sample. B. PcoA analysis of microflora in each group. C. ASV Venn diagram. D.Composition of intestinal microflora at the gate level. E. Composition of intestinal microflora at the level.Figure 4 Effect of high-fat diet on gut microbiota in rats（n ＝6）

2.4 高脂饲料对大鼠肠道内容物属水平上调控生物标志物的丰度和功能影响

LEfSe（LDA effect size）分析是一种将非参数的Kruskal-Wallis 以及Wilcoxon 秩和检验，与线性判别分析（linear discriminant analysis，LDA） 效应量（effect size）相结合的分析手段可以深入到不同的子分组（subgroup）中，挑取在不同子分组中表现一致的标志微生物类群，通过图5A 和图5B 发现乳杆菌属（g__Lactobacillus），在CG 组、HFD 组、HFD2组中发挥重要作用。 其中图5A 可以看出乳杆菌属在CG 组的丰度高于HFD 组，图5B 中乳杆菌属在CG 组的丰度高于HFD2 组，乳杆菌属可能是发挥重要作用的菌属。 图5C 表明3 组可以在功能上有较好的区分。 差异菌属主要在能量代谢、酵素家族和糖的生物合成与代谢发挥重要作用（图5D）。

注：A：CG 组和HFD 组间生物标志物的LDA 值分布直方图，LDA 评分阈值为＞4；B：CG 组和HFD2 组间生物标志物的LDA 值分布直方图，LDA 评分阈值为＞4；C：基于Bray-Curtis 相似性的肠道微生物群功能单元的PLS-DA，椭圆置信度为0.95；D：组间肠道菌群差异代谢通路，颜色强度代表物种在各样本中的丰度分布（红色：相应丰度高；蓝色：相应丰度低）。图5 高脂饲料对大鼠肠道内容物属水平上调控生物标志物的丰度和功能影响Note. A. Histogram of LDA value distribution of biomarkers between CG group and HFD group，threshold of LDA score ＞4. B. Histogram of LDA value distribution of biomarkers between CG group and HFD2 group，threshold of LDA score ＞4. C. PLS-DA of intestinal microflora functional unit based on Bray-Curtis similarity. The confidence of ellipse is 0.95. D. There are different metabolic pathways of intestinal flora among groups，and the color intensity represents the abundance distribution of species in each sample （Red. Corresponding high abundance. Blue. Corresponding low abundance）.Figure 5 Effect of high-fat diet on the abundance and function of regulating biomarkers at the level of intestinal contents in rats

2.5 高脂饮食对大鼠肠道内容物短链脂肪酸含量的影响

通过GC-MS 方法检测肠道内容物短链脂肪酸，结果如图6 所示，HFD1 组与CG 组间相比，短链脂肪酸含量均有所下降，其中总短链脂肪酸、乙酸、丁酸、异戊酸和戊酸含量下降显著（P＜0.01，其中异戊酸P＜0.05）。 HFD2 组与CG 组相比，短链脂肪酸含量也均有下降，其中总短链脂肪酸、乙酸、丁酸和戊酸含量下降显著（P＜0.01）（见图6）。

注：与CG 组相比，***P ＜0.001。 （下图同）图6 高脂饮食对大鼠肠道短链脂肪酸含量的影响（x¯±s，n ＝6）Note. Compared with CG group，***P ＜0.001. （The same in the following figures）Figure 6 Effect of high-fat diet on the content of intestinal short-chain fatty acids in rats（x¯±s，n ＝6）

2.6 高脂饮食中肠道菌群与短链脂肪酸相关性分析

基于上文对大鼠的肠道微生物组成变化分析以及短链脂肪酸含量分析，对HFD1 组与CG 组间差异菌群和差异短链脂肪酸进行皮尔森相关分析分析，如图7A 发现Lactobacillus菌与所有差异短链脂肪酸均呈现正相关（红色），其中与异丁酸呈显著性正相关（P＜0.05）。 其余菌属与所有差异短链脂肪酸呈负相关（蓝色）。 其中Clostridium sensu stricto1 菌与乙酸和总短链脂肪酸呈极其显著性负相关（P＜0.001）。 对HFD2 组与CG 组间差异菌群和差异短链脂肪酸进行皮尔森相关分析分析，如图7B，发现Lactobacillus菌和Jeotgalicoccus菌与所有差异短链脂肪酸均呈现正相关（红色），但Lactobacillus菌只与异丁酸具有显著性（P＜0.05）。 其余菌属与所有差异短链脂肪酸呈负相关（蓝色）。

注：A：HFD1 组与CG 组中差异菌群与差异短链脂肪酸皮尔森相关性分析；B：HFD2 组与CG 组中差异菌群与差异短链脂肪酸皮尔森相关性分析，颜色表示相关性。图7 高脂饮食中肠道菌群与短链脂肪酸相关性分析Note. A. Correlation analysis between differential microflora and differential short-chain fatty acid Pearson in HFD1 group and CG group. B. Correlation analysis between differential microflora and differential short-chain fatty acid Pearson in HFD2 group and CG group. Color indicated correlation.Figure 7 Analysis of the relationship between intestinal flora and short-chain fatty acids in high-fat diet

3 讨论

SCFAs 来源于肠道内菌群对未消化的碳水化合物的进一步发酵，是肠道微生物的重要代谢产物之一。 SCFAs 由乙酸、丙酸和丁酸等组成，可调控肠道内多种营养物质的吸收，同时对改善肥胖、糖尿病等慢性代谢病，维持肠道内的酸性环境十分重要［18-19］。 研究发现不同饲喂方式的高脂模型均显著降低了总短链脂肪酸、乙酸、丁酸和异丁酸的含量。 对于乙酸来讲，有研究表明乙酸可以通过分泌肠激素影响宿主能量代谢，从而通过降低全身脂解作用和全身促炎性细胞因子水平来影响食欲，并增加能量消耗和脂肪氧化［20］。 通过与肠道菌群进行关联分析，发现乳酸杆菌（Lactobacillus）与短链脂肪酸含量呈正相关，与先前报道的相关研究结论相似。 乳酸杆菌作为益生菌中广泛应用的一种，其对肠道菌群的调节显著［21］。

本研究发现与CG 组相比，HFD1 组和HFD2 组大鼠摄食量下降，体重升高；血清中TC、TG、LDL-C均显著升高；肝组织发生明显脂肪变性，肾周脂肪出现炎性病变；高脂饮食明显降低乳杆菌相对丰度、高脂干预后大鼠肠道菌群相对丰度变化显著，菌群结构和功能变化明显，其中总短链脂肪酸、乙酸、丁酸、异丁酸下降显著。 结果表明两种高脂饮食方式均能引起大鼠发生高脂血症，且发病机制基本一致，均与脂质代谢以及肠道菌群紊乱有关。 但与高脂饲料不限量饲养的造模方式相比，每日限制一定的高脂饲料饲喂量不仅能够降低高脂饲料对大鼠食欲的影响，还能更大程度地增加体重，升高血液中TC 和TG 的含量，从而提高了大鼠高脂血症模型制备的稳定性，降低了模型制备的成本，是一种值得推广应用的大鼠高脂模型制备方法。