基于网络药理学、分子对接及分子动力学模拟探讨黄连治疗溃疡性结肠炎的作用机制

陈琴，张志云，朱云婴，娄龙，李玲华，张凤琼，徐瑞，邓婷婷，高爽

昆明市中医医院 肛肠科，云南 昆明 650011

溃疡性结肠炎是局限于结肠黏膜层的复发和缓解的慢性炎症状态，发病机制包括遗传和环境因素等[1]。临床上，常表现为腹痛、腹泻、粪便中带有脓血等。该病病程长，易复发且难以治愈。该病的主要治疗目的是在于控制急性发作、维持缓解以及防止病情复发等。现有的西医治疗主要有氨基水杨酸制剂、糖皮质激素、免疫抑制剂、微生物制剂以及生物制剂等，但诸如柳氮磺吡啶、5-氨基水杨酸、激素类制剂等部分西药因存在肝肾损伤、价格较高、患者依从性等问题，使得临床运用受限[2-3]。因此，寻找更安全有效的药物治疗溃疡性结肠炎至关重要。

现代药理研究表明，黄连具有很高的药用价值，保护心脑血管、降糖、抗炎、抗肿瘤等药理作用[4]。黄连有效成分小檗碱通过调节肠道菌群结构、保护肠道屏障、调节肠道免疫和影响氧化应激来治疗溃疡性结肠炎[5-6]。尽管黄连及其有效成分治疗溃疡性结肠炎有效，但主要药理机制尚未得到充分而全面的解释。因此，在本研究中使用网络药理学[7]、分子对接和分子动力学模拟（MD）来识别黄连的主要有效成分和核心靶点，并进一步探索其治疗溃疡性结肠炎的潜在机制。

1 材料和方法

1.1 黄连化学成分筛选及靶点预测

在TCMSP 数据库检索黄连的全部化学成分，以口服生物利用度（OB）≥30%，类药性（DL）≥0.18 作为阈值，筛选活性较高的化学成分及其潜在靶点，通过Uniprot 数据库进行靶点信息比对和基因名校正。

1.2 溃疡性结肠炎相关靶点筛选

通过GeneCards、OMIM、Drugbank、TTD、DisGeNET 数据库，以“ulcerative colitis”为关键词，搜索溃疡性结肠炎的相关靶点，合并5 个数据库的所有靶点，去重后得到最终靶点。

1.3 构建蛋白质相互作用（PPI）网络图及筛选关键靶点

将黄连有效活性成分与溃疡性结肠炎的交集靶点上传至String 11.0 数据库中构建PPI 网络，参数设置为：设定生物种类为“Homo sapiens”，最小互作阈值“highest confidence”＞0.7，删除游离节点。下载tsv 格式的文件导入CytoScape 3.9.0，利用Cyto Hubb 插件以MCC、Degree、MNC、EPC 4 种算法分别筛选在整个网络节点中位于前10 位的Hub 基因。

1.4 基因本体（GO）功能和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析

通过Metascape 平台，设置“H species”，P＜0.01，分析交集靶点的GO 功能（生物过程、分子功能、细胞组成）和KEGG 信号通路富集结果。

1.5 构建药物活性成分-靶点-通路网络图

运用CytoScape 3.9.0 软件构建药物活性成分-靶点-疾病-通路网络图，根据其内置工具（Network Analyzer）分析3 个主要的网络拓扑参数：连接度（degree）、介度（betweenness）、紧密度（closenesss）。基于以上数据参数，判断复方中重要活性成分，药物作用疾病的核心靶点，揭示相关通路调节机制。

1.6 分子对接验证

从PubChem 数据库中下载小分子药物的SDF文件，并将其转换为mol2 文件，上传到Autodock Tools 1.5.6[8]中进行查看电荷、判定配体的root、设置可旋转键等处理，保存为PDBQT 格式配体。在RCSB PDB 数据库中对关键靶点进行蛋白构象筛选，下载pdb 格式文件。在Autodock Tools 1.5.6 中，删除所得蛋白结构的水分子、原小分子配体等，确定活性口袋位置。采用AutoGrid 4 拉马克遗传算法（Genetic Alogorithm）[9]进行对接运算。整理分析对接结果，根据结合自由能把受体-配体对进行筛选排序，绘制矩阵热图。采用LigPlus 2.2.4 软件绘制2D 图，在Pymol 2.2.0 软件中进行3D 可视化展示。

1.7 分子动力学模拟

MD 模拟采用Gromacs 2020.1 软件[10]，力场选择charm36-mar2019。蛋白质和分子复合物用TIP3P进行水解。采用最陡峭下降算法对其进行能量最小化（共5 000 步），之后在受约束的NVT 和NPT 中运行100 ps，使系统达到平衡状态。NPT 在NVT 平衡的基础上加以结合，稳定系统的压力。最后，对复合物进行200 ns 的MD 模拟，每10 ps 保存1 次轨迹。使用GROMACS 2020.1 计算均方根位移（RMSD）。利用gmx_mmpbsa 在线工具（https://github.com/Jerkwin/gmxtool/tree/master/gmx_mmpbsa），根据分子力学/泊松-波尔兹曼表面积（MM/PBSA）方法计算了蛋白质和分子之间的复合结合自由能。

2 结果

2.1 黄连活性成分及靶点

通过TCMSP 数据库，得到黄连活性化合物成分36 种，按阈值筛选，最终得到7 个生物活性成分，包括槲皮素、小檗碱、(R)-氢化小檗碱、木兰花碱等（表1）。通过Uniprot 数据库将7 个活性成分对应的靶点进行名称校正，删除无效值后共得到靶点137 个。

表1 黄连的主要活性成分Table 1 Main active ingredients of Coptis chinensis

2.2 溃疡性结肠炎相关靶点的获取

通过GeneCards、OMIM、Drugbank、TTD、DisGeNET 数据库查找与溃疡性结肠炎相关的靶点，将所有靶点合并后删除重复值，最终获得1 258个靶点。

2.3 构建PPI 网络图及筛选关键靶点

将药物靶点与溃疡性结肠炎靶点取交集后得到81 个靶点，并提交至String 11.0 网站，获得PPI网络。网络中共有81 个节点，590 条边，平均degree为14.6。利用Cytoscape 3.9.0 Hubba 插件以MCC、degree、MNC、EPC 4 种算法筛选在整个网络节点中位于前10 位的Hub 基因（图1）。

图1 4 种算法筛选Hub 基因的网络图Fig.1 Network diagram of four algorithms for screening Hub genes

2.4 GO 功能与KEGG 通路的富集分析

应用Metascape 数据平台对黄连治疗溃疡性结肠炎相关靶点进行分析，主要参与的生物学过程包括对无机物的反应、对细胞因子的反应等。分子功能主要富集于细胞因子受体结合、DNA 结合转录因子结合等。细胞组成主要包括膜筏、转录调节器复合体等。共获得164 条信号通路，排在前20 位的通路包括癌症的通路、脂质和动脉硬化、流体剪切应力和动脉粥样硬化、HIF-1 信号通路、MAPK 信号通路等，见图2。

2.5 构建药物活性成分-靶点-通路网络图

通过CytoScape 3.9.0 对活性成分-靶点-通路网络图中各参数的degree、betweenness、closenesss进行分析（图3），得出主要成分依次为槲皮素、小檗碱、(R)-氢化小檗碱、木兰花碱（表2）。排在前15 位的核心靶点为蛋白激酶B1（Akt1）、B 淋巴细胞 2（BCL2）、有丝分裂原活化蛋白激酶 1（MAPK1）、FOS、转录因子AP-1（JUN）、V-Rel 网状内皮增生病毒癌基因同源物A（RELA）、表皮生长因子受体（EGFR）、热休克蛋白90α 家族A 类成员1（HSP90AA1）、一氧化氮合酶3（NOS3）、周期素依赖性激酶抑制因子1A（CDKN1A）、白细胞介素-6（IL-6）、基质金属蛋白酶9（MMP9）、肿瘤蛋白p53（TP53）、Bcl-2 相关X 蛋白（Bax）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（CASP3）（表3）。

图3 药物活性成分-靶点-通路网络图Fig.3 Drug active ingredient-target-pathway network diagram

表2 黄连主要活性成分网络节点特征参数Table 2 Characteristic parameters of the network nodes of the main active ingredients of Coptis chinensis

表3 黄连主要活性成分靶点网络节点特征参数Table 3 Characteristic parameters of the nodes of the target network of the main active ingredients of Coptis chinensis

2.6 分子对接验证结果

最终筛选出的Hub 基因为Akt1、IL-1β、MAPK1、IL-6、肿瘤坏死因子（TNF）、BCL2、Bax、CXC 型趋化因子配体8（CXCL8）、CC 族趋化因子配体2（CCL2）、RELA，与黄连的有效活性成分槲皮素、小檗碱、(R)-氢化小檗碱和木兰花碱进行分子对接模拟，绘制能量矩阵图（图4）。小分子与蛋白之间结合能≤-5.0 kJ/mol，代表两者有较好的结合活性。从对接结果看，结合能小于-5.0 kJ/mol，说明小分子与蛋白之间具有较好的结合活性。其中，挑选出具有强烈结合活性，且排名前4 位的小分子与蛋白进行可视化展示（图5）。

图4 黄连主要有效成分与关键靶点的分子对接热图Fig.4 Molecular docking heat map of the main active ingredients of Coptis chinensis with key targets

图5 分子对接的可视化图Fig.5 Visualization diagram of molecular docking

2.7 分子动力学模拟

根据分子对接结果，选取具有强烈结合活性且排名第1 位的小檗碱与IL-1β 进行进一步的分子动力学模拟验证。如图6 所示，在模拟过程中蛋白结构在20 ns 后RMSD 达到平衡，小分子的RMSD 在70 ns 后达到平衡，而且小分子在模拟过程中发生了较大的移动。如图7、8 所示，蛋白在模拟过程中，回旋半径在模拟过程中非常稳定，α-C 原子除了N端氨基酸波动较大外，其他氨基酸的α-C 原子在模拟过程中波动较小。综上可知，蛋白在模拟过程中结构非常稳定。MM-PBSA 方法计算两者之间作用力，如表4 所示，两者的总结合自由能为-36.19 kcal/mol，其中范德华力和非极性相互作用占比最多，其次是静电相互作用。

图6 模拟的100 ns 过程中小分子和蛋白的RMSDFig.6 RMSD of small molecules and proteins in the simulated 100 ns process

图7 模拟的100 ns 过程中蛋白骨架原子的回旋半径（Rg）Fig.7 Simulated radii of gyration (Rg) of protein backbone atoms during 100 ns

图8 模拟的20～100 ns 过程中蛋白α-C 的均方根波动（RMSF）Fig.8 Simulated root mean square fluctuations (RMSF) of protein α-C during 20 — 100 ns

表4 MM-PBSA计算蛋白和小分子之间的平均结合能及其组分Table 4 MM-PBSA calculations of the average binding energy between proteins and small molecules and their components

3 讨论

溃疡性结肠炎是一种慢性炎症性疾病，主要影响结肠黏膜层，并由遗传和环境因素共同引起[11]。黄连是一种传统的中药，具有清热燥湿的功能，已被证明能够调节免疫反应和缓解与炎症相关的疾病[12]。黄连主要活性成分小檗碱已用于治疗消化系统疾病数个世纪[13]。在本研究采用网络药理学、分子对接和分子动力学模拟分析了黄连治疗溃疡性结肠炎的作用机制。

本研究获得了黄连7 个有效成分及其137 个靶点，包括槲皮素、小檗碱、(R)-氢化小檗碱和木兰花碱等。槲皮素具有很强的抗氧化性质，能有效抑制结肠炎的炎症损伤[14]。小檗碱通过调节肠道胶质细胞、肠道上皮细胞和免疫细胞之间的相互作用对溃疡性结肠炎的结肠发挥保护作用[15]。此外，有研究发现小檗碱对硫酸葡聚糖（DSS）引起的结肠炎、平滑肌损伤和猫的肠道微生物群失调有效果[16]。

对交集靶基因的GO 功能注释分析显示，小檗碱可以通过各种生物过程、细胞组成和分子功能调节溃疡性结肠炎。KEGG 富集分析发现癌症途径、脂质与动脉硬化、流体剪切应力与动脉硬化、HIF-1和MAPK 是主要的信号通路。研究表明，MAPK 信号通路参与了溃疡性结肠炎发病的全过程，抑制该通路可以明显降低溃疡性结肠炎引起的炎症反应和细胞凋亡[17]。

基于PPI 网络的4 个Hub 基因算法的结果，确定了10 个关键基因，包括Akt1、IL-1B、MAPK1、IL-6、TNF、BCL2、BAX、CXCL8、CCL2、RELA，这表明小檗碱可能通过这些靶标发挥抗溃疡性结肠炎的作用。Akt1 是一个与自噬相关的基因，在细胞凋亡和葡萄糖代谢等细胞过程中发挥作用。实验研究表明，Akt1 蛋白的泛素化可以通过促进自噬来减少溃疡性结肠炎小鼠中炎症因子的表达[18]。在溃疡性结肠炎小鼠模型中，IL-1β 的表达上调，可能与溃疡性结肠炎的发展和进展有关[19]。

分子对接结果显示，黄连的主要有效成分与核心靶点具有良好的对接活性，其中小檗碱、(R)-氢化小檗碱和木兰花碱与关键靶点Akt1 和IL-1β 的结合位点比较稳定。这些结果通过MD 模拟得到进一步验证，显示小檗碱与IL-1β 的结合亲和力最高，表明其内在的高生物活性。总的来说，本研究为黄连治疗溃疡性结肠炎的潜在机制提供了启示，可能为临床应用提供参考。

综上所述，本研究全面揭示了黄连治疗溃疡性结肠炎的潜在机制。研究发现，黄连中的活性成分可能调节溃疡性结肠炎发病过程中的关键靶点和信号通路。分子对接和分子动力学模拟结果进一步支持了黄连对溃疡性结肠炎的潜在治疗作用。这些结果为进一步研究和开发黄连作为溃疡性结肠炎的潜在治疗药物提供了基础。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突