传染性支气管炎病毒反向遗传系统的构建策略与应用

赵秀美，张华，贾惠，孙智远，徐孝宙，余智清，姜逸

(1. 江苏农林职业技术学院，江苏 镇江 212400；2. 江苏省家禽科学研究所，江苏 扬州 225125)

传染性支气管炎(infectious bronchitis，IB)是由传染性支气管炎病毒(infectious bronchitis virus，IBV)引起的鸡的一种急性、高度接触性传染病，该病的暴发与传播影响全球养禽业的发展[1]。IBV主要感染鸡呼吸道、肾脏、胃肠道以及生殖系统等，引起感染鸡的发病与组织损伤[2]。各种年龄段的鸡都可发病，以雏鸡最为严重。病毒可以通过与感染鸡的直接接触传播，也可以通过气溶胶和污染的饮水、饲料以及粪便传播[3]。IBV可在鸡体内和肠道中存活数周甚至数月，并通过呼吸道和粪便排出[4]。IBV的禽类宿主范围广泛，家鸡和野鸡是主要宿主；此外，健康的野生鸟类可能是家鸡和野鸡之间的传播媒介[5]。由于IBV缺乏病毒聚合酶校对机制，基因组中可持续发生基因突变和重组，导致不断出现新的变异株。此外，不同遗传谱系的IBV之间发生基因重组以及基因的易位和缺失，导致病毒血清型和基因型众多[6]。不同毒株之间交叉保护作用较弱，传统商品化疫苗对新型变异株不能产生有效保护，增加了疫病的防控难度[7]。

反向遗传操作技术通过对病毒全长基因组进行克隆，拯救获得活病毒，是研究RNA病毒分子生物学的有效方法。通过IBV反向遗传技术对病毒基因组进行突变、缺失、插入等，可以研究病毒蛋白功能或单个基因在发病机制中的作用。针对IBV流行株，传统弱毒疫苗制备过程耗时费力，而且疫苗稳定性低，存在毒力返强的风险。借助反向遗传技术可以对毒力相关基因进行突变或删除，构建减毒疫苗株，克服疫苗研制的局限性[8]。此外，该技术也可用于研究IBV不同血清型和致病型毒株的感染与发病机理。IBV基因组较大，而且难以在传代细胞系上增殖，导致IBV反向遗传系统的构建较为困难，分子水平的研究工作受到限制。近年来，国内外研究团队突破技术瓶颈，建立了多个IBV反向遗传系统，为病毒分子水平研究提供了平台，推动了IBV致病机制研究和新型基因工程疫苗的研发。

1 IBV基因组结构和功能概述

IBV属于冠状病毒科γ冠状病毒属，病毒粒子直径120 nm，冠状突长20 nm。IBV的基因组为不分节段的单股正链RNA，全长约27.6 kb[9]。基因组结构为5′UTR-1a/1ab-S-3a-3b-E-M-5a-5b-N-3′UTR，其两端包含5′帽子结构和3′多聚腺苷酸尾巴。基因组结构5′端2/3的区域编码多聚蛋白pp1a和pp1ab，多聚蛋白通过自身蛋白酶水解裂解成15个非结构蛋白[10]。基因组靠近3′端的1/3区域编码结构蛋白和种属特异性ORF。ORF2编码S蛋白，该蛋白是目前研究最多的结构蛋白，作为一种跨膜蛋白，S蛋白决定了病毒典型的冠状结构[11]。在病毒感染宿主过程中，S蛋白裂解为S1和S2两个亚基，位于S1的受体结合区是决定病毒宿主和组织嗜性的主要区域[12]。病毒相关抗原表位主要位于S1蛋白上，S基因可用于IBV变异株的基因型分类，但由于缺乏共同的分类和命名标准，IBV流行病学的研究较为复杂。S2亚基较为保守，包含跨膜结构域，将S蛋白锚定在包膜上[13]，是病毒融合的基础[14]。S1和S2亚基与宿主之间的相互作用决定了病毒附着的亲和性与特异性，从而决定了病毒组织嗜性和宿主范围[15]。ORF3位于ORF2的下游，是一个多顺反子基因，编码3a、3b和3c蛋白。早期研究表明，3a、3b 蛋白为辅助蛋白，与病毒的复制无关[16]。3c蛋白也称包膜蛋白或E蛋白，是病毒粒子包膜的重要组成部分[9]。M蛋白是由ORF4编码的，是病毒粒子中含量最多的结构蛋白，在病毒粒子中以二聚体的形式存在，可能采用两种不同的构象，促使膜面弯曲并与核衣壳结合[17]。ORF5编码辅助蛋白5a、5b，5a蛋白与病毒在Vero细胞中的复制无关[18]。研究表明，辅助蛋白3a、3b、5a、5b缺失导致病毒在1日龄雏鸡体内毒力减弱[19]。ORF6编码的N蛋白是核衣壳中唯一存在的蛋白，与病毒复制相关，位于核糖核蛋白核心。M蛋白与核衣壳结合，促进了病毒粒子的组装[20]。

2 IBV反向遗传系统的构建策略

近年来，已成功用于操纵冠状病毒基因组的反向遗传学技术包括细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome，BAC)系统、体外连接系统、痘病毒载体系统、靶向RNA重组系统和转化相关重组克隆等。尽管各个系统均存在优点和不足，但通过反向遗传操作技术对IBV基因进行有目的地修饰和改造推动了IBV研究的发展。

2.1 基于BAC系统的感染性cDNA克隆

基于BAC的反向遗传学系统是目前冠状病毒研究中最有价值的系统。首个冠状病毒的全长感染性克隆是基于BAC系统进行病毒基因组构建的[21]。BAC系统可容纳较大的外源基因或者DNA片段[22]，外源序列稳定性高；在BAC质粒中组装病毒基因组全长cDNA，基因修饰和筛选方法较为成熟。BAC克隆基因组较大，每个细胞中仅有1～2个拷贝数的质粒，低拷贝数以及隔离的环境，限制了细胞内BAC分子间的重组[23]。在BAC系统中进行基因操作相对容易，cDNA转染进入哺乳动物细胞并表达的效率高[24]。然而，在诱变过程中，病毒基因对细菌有一定的毒性，为防止病毒在细菌增殖过程中产生突变，需要每次对质粒中的全基因组序列进行测序鉴定。

针对H120疫苗株，吕晨翡等[25]将其基因组分为4个片段进行扩增，用同源重组方法分别将其构建到 BAC载体中获得4个片段亚克隆载体，进而完成全长 cDNA 克隆载体的构建。在此基础上，该课题组进一步构建了嵌合 IBV 野毒S1 基因的重组疫苗株，并对其进行了致病性分析。研究发现以H120株的4个亚克隆片段为基础，通过同源重组，获得了插入IBV全长基因组cDNA的pBAC重组载体[26]。在此基础上，将H120株的S1基因替换为强毒株的S1基因，将重组病毒转染至BHK细胞，并在鸡胚中传代，拯救重组病毒。针对Beaudette株，Xing等[27]以Beaudette-FUB株的cDNA为模板，通过PCR将基因组分为6个片段进行扩增，分别克隆到pUC18质粒中。随后，将6个片段依次克隆到修饰的BAC载体中，构建全长基因组cDNA。Inayoshi等[28]将弱毒株 C-78E128基因组分为8个连续片段进行扩增，构建全长cDNA并克隆至BAC载体中。将得到的BAC克隆转染到293T细胞中进行病毒拯救，通过嵌合表达外源S基因，证实了S基因与血清特异性病毒中和抗体相关。

2.2 基于体外连接的感染性cDNA克隆

体外连接系统是使用限制性核酸内切酶将识别位点处的碱基进行分离，分段扩增cDNA片段并在体外顺序连接，进行病毒全长cDNA的组装。全长cDNA包括5′端T7 RNA聚合酶和3′端poly(A)尾巴，体外转录形成具有帽子结构的mRNA后，转染到易感细胞内进行病毒拯救。体外连接转录系统主要依赖T7 RNA聚合酶，可以降低病毒cDNA片段在细菌中的不稳定性和毒性[29]。然而，通过该方法获得病毒需要对所有亚克隆片段进行酶切、连接以及纯化全长cDNA，操作过程繁琐，对于DNA的体外合成技术要求较高。

冠状病毒首个体外连接系统是针对猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus，TGEV)构建的全长感染性cDNA克隆[30]。将病毒基因组体外克隆的cDNA片段进行顺序连接，组装成全长cDNA。通过体外转录获得病毒mRNA，电转染到BHK-21细胞中，成功拯救重组病毒。该研究证明同时表达N蛋白有助于提高重组病毒的拯救效率。研究表明，磷酸化的N蛋白比非磷酸化或部分修饰的N蛋白能更有效地拯救获得感染性IBV[31]。针对H120疫苗株，周生等[32]采用RT-PCR方法将其基因组分为10个片段进行扩增，克隆至pMD19-T载体，将各DNA片段进行体外连接，获取H120株的基因组全长cDNA。通过T7 RNA聚合酶体外转录系统合成病毒基因组RNA，转染BHK-21细胞并进行病毒拯救。此外，该团队以相同的方法对QX型毒株IBYZ全基因组分为10个片段扩增，成功构建了QX型强毒株的反向遗传系统[33]。Zhou等[34]体外扩增H120株13个病毒基因组片段，克隆到pMD19-T载体中。在T4连接酶作用下，体外连接病毒的全长cDNA，将全长基因组cDNA转录子与N基因转录子共同电转染至BHK-21细胞中，收获细胞并接种到SPF鸡胚中成功拯救了H120的感染性克隆。魏衍全等[35]利用RT-PCR技术扩增得到H120株S基因胞外域，置换到Beaudette株全长cDNA克隆相应区段，构建了含有上述区段的重组cDNA克隆BeauR-H120(S1)。李然等[36]将M41株全基因组分为14段分段扩增，体外拼接成基因组全长cDNA，成功构建了IBV经典毒株M41株的感染性克隆。许纪刚等[37]分13个片段扩增H52株全长cDNA，采用改进的No see’m连接技术和多片段同时连接的方法，成功体外连接出病毒的全长cDNA，拯救并获得了H52株的反向遗传株。翁文莲[38]等以 IBV 细胞适应株 Beaudette-R为研究对象，通过体外连接技术，构建并拯救获得Nsp15核酸内切酶活性缺陷型重组病毒，探讨Nsp15在IBV感染和复制过程中的作用。

2.3 基于痘病毒载体的感染性cDNA克隆

痘病毒作为一种基因组大的DNA病毒有以下优点：痘病毒可容纳大的外源基因片段，并且病毒本身的感染性和复制能力不受影响；插入的外源基因片段可在痘病毒基因组中稳定复制并表达，不需要依赖原核表达系统；痘病毒作为全长cDNA的载体，可以通过同源重组对痘病毒进行基因修饰，便于对冠状病毒基因组克隆进行基因突变、插入或缺失[39]。

基于痘病毒载体的反向遗传系统最先用于重组HCoV-229E的构建，研究人员将病毒基因组克隆至痘病毒中，在体外以cDNA为模板转录生成感染性RNA，拯救获得重组病毒[40]。IBV首个反向遗传系统是针对Beaudette株痘病毒载体的感染性克隆的构建。首先，在T7 RNA聚合酶启动子下游组装IBV基因组cDNA，克隆到痘病毒基因组中，构建重组痘病毒。随后，将重组痘病毒与表达T7 RNA聚合酶的鸡痘病毒共同转染到CK细胞中，拯救获得感染性克隆[41]。在IBV痘病毒反向遗传操作系统基础上，Bickerton等[42]进一步优化方法，使用瞬时显性选择法在IBV cDNA中引入修饰，感染表达T7 RNA聚合酶的重组痘病毒，共转染CK细胞，拯救获得重组病毒。针对强毒株YN株，Zhao等[43]建立了基于痘病毒的反向遗传系统。将YN株全基因组分为10个片段进行扩增，通过同源重组克隆到痘病毒中。体外转录全长基因组cDNA，将转录子转染到稳定表达N蛋白的BHK-21/N细胞中，进行病毒拯救。48 h后收获细胞培养物并接种到10日龄SPF鸡胚中进行病毒增殖。

2.4 靶向RNA重组

冠状病毒基因组较大，复制酶区域存在不稳定性，使冠状病毒基因组作为cDNA克隆在大肠杆菌中增殖较为困难。为了克服这些障碍，Masters等[44]在尚不清楚能否构建全长感染性cDNA克隆的情况下，建立了靶向RNA重组技术。靶向RNA重组系统基于S基因的交换，可将不同宿主依赖性的冠状病毒S基因进行交换，便于对不同物种的易感细胞进行选择。靶向RNA重组最先应用于小鼠肝炎病毒(mouse hepatitis virus，MHV)[45]，构建MHV感染性克隆分为两步，首先构建携带MHV S基因并具有严格小鼠细胞亲和力的嵌合冠状病毒，随后在病毒特异性适应细胞上拯救靶向重组病毒。基因操纵主要集中在IBV基因组结构3′端区域。靶向RNA重组构建方便，可用于拯救高度变异的毒株。由于该系统是基于细胞水平上的冠状病毒增殖，因此不适用于致病性IBV。 但是，可以将IBV基因组RNA转染到非易感细胞中，用MHV的S基因替换IBV S基因，在转染细胞中拯救重组病毒。van Beurden等[46]以弱毒株H52株为研究对象，构建了IBV靶向RNA重组系统。首先，将IBV基因组 RNA和携带MHV S基因的嵌合IBV转录子共转染到非易感细胞中，以生成重组嵌合鼠化IBV中间体(mIBV)，此时，由于IBV编码S蛋白外胞外域的基因组被MHV基因组取代，可在小鼠细胞内进行增殖；随后，mIBV作为受体，通过引入完整的IBV S基因，构建包含IBV基因组3′端的重组RNA，在鸡胚中拯救获得重组毒株。重组病毒在鸡胚以及1日龄雏鸡体内的表型特征与野毒株相似。

大多数IBV毒株，包括田间分离株，只能在鸡胚中增殖，不能在连续传代的细胞系中感染和增殖。靶向RNA重组技术为这类毒株感染性克隆的构建提供了可能。应用靶向RNA重组技术修饰IBV基因组3′端编码结构蛋白和辅助蛋白的基因，可以对强毒株结构蛋白和辅助蛋白基因进行研究[46]。通过引入特定突变，为IBV减毒活疫苗的构建和生物学特性研究打下基础。但是，靶向RNA重组技术有严格的限制性，它不能在编码复制酶的基因上进行操作。

3 IBV反向遗传系统的应用

IBV反向遗传系统通过替换、缺失或插入核苷酸等定点突变产生重组病毒，是研究病毒分子生物学和致病机制的重要方法。目前IBV反向遗传系统主要用于病毒基因组结构和功能研究、新型疫苗研发和病毒表达载体研究等。

3.1 病毒基因组结构和功能研究

为研究IBV S蛋白与病毒致病性的关系，Hodgson 等[47]利用反向遗传技术将Beaudette株的S蛋白基因替换为致病型M41株的S蛋白，研究发现表达M41株的S蛋白的Beau-R仍是非致病性的，但免疫鸡后可对M41株产生保护作用。试验发现，利用BAC反向遗传系统将H120株的S1基因替换为野毒株SC021202的S1基因，可拯救获得重组毒株rH120/SCS1[26]。雏鸡致病性试验表明，雏鸡免疫rH120/SCS1可对SC021202产生免疫，但重组毒株rH120/SCS1不具有致病性，说明S1蛋白可能不是SC021202高致病性的关键因素。针对QX型强毒株YN株，Zhao等[48]借助反向遗传技术，将YN株的S基因或5a基因替换为弱毒株aYN株的相应区域，构建并拯救获得重组病毒rYN-S-aYN 和 rYN-5a-aYN。重组病毒在鸡胚中表现为减毒表型，感染雏鸡表现为死亡率降低、体内病毒滴度下降、组织损伤程度降低，从而证明了S基因和5a基因是强毒株毒力减弱的主要原因。

为研究IBV S蛋白高变区(hypervariable region，HVR)在病毒致病性和组织嗜性中的作用，Shan等[49]利用反向遗传技术将IBV Beaudette株的3个HVR分别或同时替换为QX型肾型毒株ck/CH/LDL/091022的相应片段，构建并拯救获得7株重组IBV。通过细胞和鸡胚增殖试验、SPF雏鸡体内致病性试验探索HVR的功能。为研究病毒S蛋白与细胞嗜性的相关性，Bickerton等[50]通过反向遗传技术将 Beaudette株的S蛋白膜外片段与强毒株M41-CK的相应区域替换，得到了具有M41-CK的体外细胞嗜性的重组毒株BeauR-M41(S)。研究表明，S2亚基决定病毒在Vero细胞中的亲嗜性，S2裂解位点附近的3个氨基酸突变与Beaudette株适应Vero细胞相关。姜逸等[51-52]借助反向遗传操作技术，以H120疫苗株、QX型毒株IBYZ和YZ120毒株的基因组为骨架，分别对S、S1或S2基因进行嵌合表达，确定了V617I的突变是YZ120毒株适应原代CK细胞的关键位点。

IBV反向遗传系统还可以应用于辅助蛋白的功能研究。Laconi等[19]基于靶向RNA重组系统缺失H52株的辅助基因3a、3b、5a和5b，通过鸡胚接种试验和1日龄SPF雏鸡感染试验，证明缺失辅助基因导致重组病毒产生减毒表型。针对QX型强毒株，在IBYZ株反向遗传系统的基础上，拯救获得IBYZ株辅助蛋白3a、3b沉默表达的重组病毒。1日龄SPF雏鸡攻毒试验表明，辅助蛋白缺失的重组病毒在雏鸡体内的致病性减弱，其中辅助蛋白3b缺失的致病性减弱作用较为明显[33]。

3.2 新型疫苗研究

疫苗免疫是预防IBV感染的有效途径。市售疫苗大多为灭活疫苗和弱毒疫苗，灭活疫苗虽然安全性好，但是制备成本较高，且免疫效果不理想；弱毒疫苗是由病毒在鸡胚中连续传代产生的毒力减弱但保留免疫原性的活毒株，在鸡体内有一定的致病性，且存在毒株变异与毒力返强的风险。根据S1基因的系统进化分析，目前我国的主要流行毒株为QX型毒株[53]，与Mass型毒株的核苷酸同源性较低[54]，传统弱毒疫苗如H120属于Mass型毒株，针对QX型毒株的保护性差。反向遗传学技术在RNA病毒疫苗研发中起重要作用，通过反向遗传技术开发基因型匹配疫苗、减毒活疫苗、广谱疫苗载体或基因标记重组疫苗等，能够针对不同血清型或基因型毒株产生免疫，比灭活疫苗或弱毒疫苗更为安全高效。

现有疫苗的交叉保护效果较差，为阐明S1蛋白在免疫保护中的作用，Ellis等[55]借助反向遗传操作系统，以Beaudette株为基础，用重组IBV进行同源疫苗接种试验。结果表明，S1蛋白与不同血清型产生交叉保护作用有关。因此，针对致病性Beaudette株设计减毒活疫苗可以诱导免疫保护。Bickerton等[56]以Beaudette株为骨架，借助反向遗传技术将H120或QX型强毒株的S1基因替换Beaudette株S1基因，构建并拯救获得重组病毒BeauR-H120(S1)和 BeauR-QX(S1)，获得的重组病毒能够在原代鸡肾细胞和Vero细胞中复制，为研发能在 Vero细胞中有效复制的IBV疫苗奠定基础。Ting等[57]借助反向遗传技术，将Beaudette-p65株S1基因替换为QX型KC分离株的S1基因，拯救了嵌合S1基因的rIBV-Beaudette-KC(S1)，该重组病毒免疫雏鸡可产生较高水平的免疫应答反应，并能够对M41株和QX型毒株产生较好的交叉保护效果，可作为疫苗候选株。Jiang等[58]利用体外连接反向遗传技术，以疫苗株H120为骨架，将S1基因替换替换为QX型强毒株的S1，构建并拯救获得重组病毒rH120-S1/YZ。重组病毒对1日龄雏鸡的安全性好且能够产生针对强毒株的免疫保护力，可作为QX型流行毒株的候选疫苗。van Beurden等[59]以H52为研究对象，建立了基于靶向RNA重组技术的反向遗传系统，通过该系统删除了IBV基因组中辅助基因3和基因5，构建并拯救获得重组病毒。重组毒株在鸡胚中的复制与亲本株相似，证实了基因3和基因5不是病毒复制必需的。病毒缺失基因3或基因5后毒力降低，对M41株的攻毒具有保护作用，为新型减毒疫苗株的研发打下基础。Keep 等[60]建立了致病性毒株 M41株的反向遗传系统，通过对复制酶基因进行特异性修饰，确定了毒力致弱的靶向基因，为IBV减毒活疫苗的开发提供新的方向。

3.3 病毒表达载体研究

为探讨IBV作为载体表达外源基因的可行性，周生等[61]利用反向遗传技术，将H120株基因组中的5a基因编码区替换为增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因，拯救获得重组病毒H120-5a/EGFP株。该重组毒株在鸡胚中能有效复制和传代，并表达绿色荧光蛋白，证实通过替换IBV基因组中的5a基因来表达外源基因是可行的。Bentley 等[62]利用反向遗传学技术制备了表达EGFP和人源化海肾荧光素酶的感染性重组病毒。姜逸等[63]以H120为载体，将鸡IFN-γ(ChIFN-γ)基因替换了5a基因编码区，拯救获得H120-cIFNγ/5a病毒株，并对其感染鸡胚的能力以及在鸡胚中的传代稳定性进行了评估，为以IBV为载体的新型基因重组疫苗的研制奠定基础。Yang等[64]借助反向遗传系统，以H120株为载体，构建并拯救获得表达新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)血凝素-神经氨酸酶(haemagglutinin-neuraminidase，HN)蛋白的重组病毒R-H120-HN/5a。重组病毒接种SPF鸡胚后，其增殖曲线、致病性和病毒滴度与H120亲本株相似，而且具有NDV的血凝活性。重组病毒接种SPF鸡后，诱导产生的IBV特异性IgG抗体水平与市售二价疫苗LaSota/H120相当，对IBV致病性毒株M41和NDV强毒株感染提供了有效保护。因此，IBV可作为二价疫苗的载体，通过表达外源基因预防IBV与其他病原体的感染。

病毒作为载体表达外源基因取决于多种因素，包括病毒的遗传背景、插入外源基因在病毒基因组中的位置，以及替换基因是否影响病毒复制等[62]。重组IBV的稳定性取决于外源基因组位置、基因表达所需的病毒基因组修饰水平以及插入外源基因后IBV结构蛋白的表达效果。IBV辅助基因不是病毒复制所必需的，因此可以对辅助基因进行删除或替换，成为表达载体的靶点。

4 小结

反向遗传操作技术通过构建病毒感染性分子克隆，在cDNA分子水平上进行基因操作，进一步产生具有生物活性的RNA分子，解决了RNA病毒基因组难以操作的困难。通过反向遗传操作技术可以在病原学基础上研究RNA病毒的结构、基因以及氨基酸位点的功能，有助于RNA病毒的生物学特性研究。

冠状病毒的基因组大，全长cDNA的构建较为困难。使用传统的质粒DNA克隆技术不能确保大片段cDNA的稳定性。一些冠状病毒的基因序列对于大肠杆菌具有毒性，不能克隆到传统的质粒载体中，或者不能在真核载体系统中传代。直到21世纪初，才成功构建IBV全长感染性克隆。大部分IBV反向遗传操作系统是基于Beaudette株或者Mass型毒株建立的。Beaudette株是细胞适应株，能在Vero细胞上增殖，但在鸡体内没有致病性。Mass型毒株与我国流行的QX型毒株的基因型差距较大。近年来，研究人员针对QX型毒株建立了多个反向遗传操作系统，并进行了QX型毒株的免疫学和体内致病性的研究，为IBV发病机理研究和疫病防控打下了基础。IBV反向遗传技术不断发展成熟，在病毒致病机制研究和基因工程类疫苗研发等方面取得了突破性进展，是病毒的分子生物学研究、致病机制研究以及新型疫苗研发的重要途径。