miR-191-5p通过靶向TJP1调控Cal-27细胞增殖、侵袭和迁移的体外研究

佟雪溪,赵 刚,2

口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma, OSCC)是头颈部癌症患者最常见的杀手之一,尽管在诊断和治疗方面取得一定进展,但复发率和死亡率仍然很高,寻找新的生物标志物对早期发现、病中监测以及疾病预后预测具有重要意义。研究数据显示下调的miR-191-5p通过靶向TJP1来抑制OSCC。

miRNA是长度为18～25个核苷酸的短链非编码RNA,其与基本上所有已知的病理和生理过程(包括癌症)相关联。miRNA对癌症相关机制影响的研究集中在细胞增殖、对细胞死亡的抗性、上皮间质转化过程诱导的转移和血管生成[1]。循环miRNA可作为癌症生物标志物,miRNA组合可用于癌症风险预测,已经有研究者进行了几项涉及miRNA检测的早期临床试验[2]。有研究证实miRNA在血清中可以相当稳定并且易于通过各种测定法被检测[3],这说明了miRNA作为早期癌症生物标志物的可能性。

miR-191是miR-191/425簇的一部分,该簇是高等真核生物的重要参与者,位于人类3号染色体(3p21.31)上 DALRD3 基因的第一个内含子,编码四种成熟miRNA:miR-191-5p、miR-191-5p-3p、miR-425-5p和 miR-425-3p。有研究表明miR-191-5p在细胞分化和发育中起重要作用,包括加速促进衰老[4]、促进红细胞生成[5]以及成骨方面[6]发挥了重要介质作用。miR-191是一种高度保守的miRNA,它被发现在20 多种不同的癌症中异常表达,并被证明是其中一些癌症的主要参与者。最近的研究发现口腔鳞癌患者外周血中miR-191高度表达,认为其是具有较高早期诊断潜力的生物标志物[7]。本研究通过开展体外实验探究miR-191-5p对OSCC细胞的影响及其机制,为OSCC的靶向治疗提供新的治疗靶点和治疗策略。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料

Trizol、Lipo3000试剂购自美国Invitrogen,miR-191-5p inhibitor、inhibitor NC和si-TJP1、si-NC购自淼灵质粒平台,逆转录试剂盒HiScriptⅢ RT SuperMix for qPCR和ChamQ Universal SYBR试剂盒购自南京Vazyme公司,CCK-8试剂盒购自博士德公司,TJP1、GAPDH 抗体购自武汉ABclonal公司,E-cadherin、N-cadherin、Vimentin抗体购自上海Abways公司,双荧光素酶检测试剂盒购自上海碧云天公司,miRNA第一链cDNA合成(加尾法)试剂盒和miRNA荧光定量PCR试剂盒(染料法)购自上海生工。

1.2 生物信息学分析

从StarBase数据库( http://starbase．sysu．edu．cn)中的 Pan-Cancer 模块中分析miR-191-5p得到miR-191-5p在多种癌症中的差异表达数据。接着使用公开数据库TargetScan、miRBase和miRanda分析miR-191-5p的候选靶基因并取交集。得到的候选靶基因分别在StarBase数据库Gene Differential Expression模块中分析在人头颈部鳞癌中的表达差异,并在RNA-RNA CoExpression模块进行miR-191-5p与候选靶基因的相关性分析。

1.3 细胞转染与分组

人口腔鳞癌细胞Cal-27购自武汉普诺赛生命科技有限公司。将细胞培养在含有10%胎牛血清(BI,以色列),1%青-链霉素(博士德,中国)的完全DMEM高糖培养基(Gibco,美国)中,37 ℃和5%CO2的培养箱培养。按照lipo 3000转染步骤,对Cal-27细胞转染miR-191-5p inhibitor、inhibitor NC,空白组为空转染的Cal-27细胞。为验证TJP1的作用,设计细胞分组为对照组(转染miR-191-5p inhibitor+si-NC)和实验组(转染miR-191-5p inhibitor+si-TJP1)。

1.4 qRT-PCR检测

采用Trizol法提取细胞总RNA,使用超微分光光度计(Colibri)测量RNA浓度和纯度,按照逆转录试剂盒说明书获得cDNA反应液。按照SYBR试剂盒说明对miR-191-5p和TJP1 mRNA的表达水平进行检测。分别以U6和GAPDH作为内参,实验设置6个重复。采用2-ΔΔCt法分析目的基因的相对表达量。引物序列见表1。

表1 引物序列

1.5 CCK-8增殖检测

将转染处理后对数生长期细胞,接种于96孔板中1 000个/孔,分别培养24、48、72、96 h后每孔加入CCK-8试剂(1∶9),置培养箱内继续培养1 h,用酶标仪测定波长490 nm处吸光度值(optical density,OD)。

1.6 细胞克隆形成实验

将每组转染后的细胞确认转染效率合适后,用0.25%胰蛋白酶分离并分散成单细胞,将每组细胞悬液细胞计数后以1×103个/孔的密度接种于6孔板中,置于37 ℃,5% CO2培养箱中培养。当培养皿中单个克隆细胞团镜下数量大于等于50个时可停止培养,0.1%结晶紫溶液染色,用倒置显微镜拍照并统计集落数量。

1.7 Transwell实验检测

Matrigel胶包被Transwell小室上室,将2×104个细胞接种到含无血清培养基的上室中,在小室下室中加入600 μL含20%胎牛血清的DMEM培养基。37 ℃,5% CO2培养24 h,用PBS清洗小室3次,用4%多聚甲醛固定小室30 min,擦去Matrigel胶及未侵袭的细胞,0.1%结晶紫染色。用PBS洗净,干燥后正置显微镜观察,随机观察6～10个视野,记录每个视野内阳性细胞数并进行统计分析。

1.8 划痕实验检测

将细胞接种到六孔板中,分别进行转染处理。用200 μL无菌枪头垂直于横线划痕。用PBS洗涤去除悬浮细胞和细胞碎片。添加新鲜的无血清培养基,倒置荧光显微镜拍照记录0 h细胞愈合图像,培养板放入恒温培养箱中继续培养,每隔12 h取出6孔板拍照记录细胞的伤口愈合情况至伤口完全愈合;收集图片数据,Image J软件分析细胞伤口愈合率。

1.9 双荧光素酶报告基因实验

通过生信网站预测miR-191-5p与TJP1的结合位点,将miR-191-5p与TJP1结合部位的序列及其突变体序列插入到萤火虫荧光素酶基因下游构建表达载体(Promega,美国)。将miR-191-5p mimics与pmirGLO-TJP1-WT/MUT重组质粒,以及对照组mimics NC与TJP1的野生型或突变型重组质粒,利用Lipo3000转染至293T细胞。转染48 h后,根据双荧光素酶报告基因检测试剂盒说明书检测荧光素酶活性。

1.10 Western blotting检测

使用细胞裂解液提取细胞总蛋白,用BCA试剂盒测定蛋白浓度。取20 μg蛋白加1×上样缓冲液煮沸变性,通过SDS-PAGE将蛋白分离并转移到PVDF膜上。5%脱脂奶粉封闭1 h后,加入一抗,4 ℃过夜孵育。次日洗膜3次,加入二抗,在温室中孵育1 h。再洗膜3次后,加入发光试剂使蛋白显影,置于凝胶成像系统中采集图像。以GAPDH为内参,Image J软件计算蛋白相对表达量。

1.11 统计学分析

使用GraphPad Prism 8软件用于数据处理分析与图形绘制。实验重复三次,数据表示为平均值±标准偏差。两组之间的比较使用t检验分析,多组比较使用单因素或双因素方差分析。P<0.05表示差异显著并具有统计学意义。

2 结 果

2.1 miR-191-5p在OSCC中高表达

中山大学StarBase数据库分析显示,相比于正常组织miR-191-5p在癌组织中表达量高(图1),而OSCC是最常见的头颈部癌症类型,因此我们有理由怀疑miR-191-5p可能在OSCC进展中起重要作用。

图1 miR-191-5p在口腔鳞癌组织中表达上调

在TJP1的3′-非翻译区(3′-UTR)中发现了miR-191-5p的互补区。在先前的研究中,miR-191-5p已被验证为在肝细胞癌中通过抑制TJP1的信号传导增加HCC细胞侵袭性[8]。进一步研究miR-191-5p在OSCC中的潜在机制,StarBase数据库分析结果发现与非癌组织相比人OSCC组织中TJP1表达水平下调(图2)。为进一步探讨miR-191-5p与TJP1在口腔鳞状细胞癌中的关系,对两者的共表达相关性分析显示TJP1的表达与miR-191-5p呈负相关,P<0.05有统计学差异(图3)。

图2 TJP1在口腔鳞癌组织中表达下调

图3 TJP1与miR-191-5p表达呈负相关

2.2 下调miR-191-5p可抑制口腔鳞癌细胞增殖

与inhibitor NC组比较,miR-191-5p inhibitor组细胞中miR-191-5p的表达显著降低(图4A)。CCK-8实验结果显示空白组和inhibitor NC组在24 h后细胞增殖能力明显提升,而miR-191-5p低表达后Cal-27细胞的增殖能力较inhibitor NC组显著降低(图4B)。克隆实验结果显示,与对照组相比miR-191-5p inhibitor组细胞集落数量少,说明细胞集落形成能力显著降低(图4C)。

A:qRT-PCR检测转染效率;B:CCK-8法检测细胞增殖;C:克隆实验0.1%结晶紫染色图;****:P<0.000 1

2.3 下调miR-191-5p抑制口腔鳞癌细胞的转移和上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)

Transwell实验和划痕实验结果显示,与inhibitor NC组比较,miR-191-5p inhibitor组Cal-27细胞的侵袭细胞数目减少、相对迁移率变小(图5),这说明了抑制miR-191-5p减弱了Cal-27细胞的侵袭迁移能力。EMT在癌细胞恶性转化中起到关键作用,Western blotting结果显示敲低miR-191-5p后,Cal-27细胞中E-cadherin的表达显著升高,N-cadherin和Vimentin的蛋白表达水显著降低(图6)。表明降低miR-191-5p参与抑制OSCC细胞的转移和EMT形成。

A:Transwell测定法测定细胞侵袭;B:划痕愈合测定法测定细胞迁移。**:P<0.01

A:蛋白条带表达;B:蛋白表达量化比较;**:P<0.01

2.4 miR-191-5p靶向TJP1

通过生信数据库预测结果可知,miR-191-5p与TJP1间存在互作序列(图7)。双荧光素酶报告基因实验结果显示,miR-191-5p过表达组的荧光素酶活性显著低于mimics NC组。然而,TJP1的3′-UTR区突变组的荧光素酶活性表现出不同的结果,证实miR-191-5p可以靶向结合TJP1(图8)。Western blotting检测结果显示,TJP1蛋白表达在过表达miR-191-5p的细胞中显著降低,而抑制miR-191-5p可上调TJP1表达(图9A),qRT-PCR结果也显示过表达miR-191-5p后细胞中TJP1的表达降低(图9B);上述结果表明TJP1是miR-191-5p的靶向基因。

图7 miR-191-5p与TJP1的靶向结合位点

****:P<0.000 1

A:WB检测TJP1的表达;B:qRT-PCR检测过表达miR-191-5p后TJP1的表达;**:P<0.01 vs. mimics NC/inhibitor NC;****:P<0.000 1 vs. mimics NC

2.5 miR-191-5p通过靶向TJP1促进OSCC的进展

qRT-PCR结果显示 miR-191-5p低表达的细胞中转染siRNA-TJP1 成功下调了 TJP1 的表达(图10A),实验进一步检测对比miR-191-5p inhibitor+si-NC组,同时下调TJP1后Cal-27细胞的增殖能力增强、侵袭细胞数增多、细胞迁移率明显增强,表明下调TJP1可以在一定程度上逆转miR-191-5p对Cal-27细胞增殖和迁移侵袭的抑制(图10B～D),这些结果表明miR-191-5p操控并抑制TJP1从而促进OSCC细胞的增殖、迁移和侵袭。

A:qRT-PCR验证转染效率;B: CCK-8法检测细胞增殖;C:Transwell实验检测细胞侵袭能力;D:划痕实验检测细胞迁移能力;****:P<0.000 1; **:P<0.01

3 讨 论

口腔鳞状细胞癌(OSCC)是最常见的侵袭性癌症之一。虽然目前手术切除、化学疗法和放疗能够被用于治疗OSCC患者,但由于OSCC具有较强的侵袭和转移性质,患者在术后往往会出现复发、肿瘤转移或生存差的情况[9],迫切需要揭示OSCC发生发展的分子机制以开发新颖有效的OSCC治疗策略。本研究数据显示下调的 miR-191-5p 通过靶向TJP1来抑制OSCC。

miRs失调与口腔癌的癌变和进展有关,通过与mRNA 3′-UTR结合导致mRNA降解或翻译受阻,在癌症发生发展过程中发挥复杂多样的功能[10]。以口腔鳞癌OSCC为例,新型LINC00472通过miR-455-3p/ELF3轴抑制口腔鳞状细胞癌生长[11];miR-340-5p靶向内质网应激蛋白PERK和ATF6,以影响口腔鳞状细胞癌增殖和侵袭[12]。miR-191-5p的功能因肿瘤而异,到目前为止,许多证据表明miR-191-5p在肿瘤发生及乳腺癌[13]、结肠癌[14]等多种癌症中的失调中起重要作用。然而在一些癌症中miR-191-5p呈下调表达,如在肾细胞癌细胞系中的下调[15]与本研究结果相矛盾。但目前在OSCC中的作用及相关机制尚不清楚。通过本研究发现miR-191-5p在OSCC组织及细胞中表达显著升高,体外实验显示敲低miR-191-5p能够抑制OSCC细胞增殖、侵袭和迁移能力。

EMT是一种常伴随肿瘤转移和侵袭的生物学活动[16],目前认为,EMT发生的主要标志是E-cadherin表达降低、N-cadherin和Vimentin的表达升高,引起肿瘤细胞间的黏附能力下降,运动能力增加,肿瘤细胞更易发生浸润或转移。Transwell和划痕愈合测定以及蛋白质印迹分析的结果表明,随着E-cadherin表达的改善,下调的miR-191-5p抑制 OSCC增殖、侵袭迁移和EMT,并降低N-cadherin和Vimentin水平。有研究显示在肺癌细胞中,miR-191-5p 促进细胞侵袭迁移以及EMT并具有癌症干细胞样特性[17]。研究结果显示体外下调miR-191-5p抑制了口腔鳞癌细胞生长和EMT,下调的miR-191-5p可能有助于阻断OSCC进展。

为进一步揭示miR-191-5p的潜在作用机制,生物信息学分析发现TJP1是其潜在的靶基因,并通过双荧光素酶报告基因测定进行了验证。TJP1(也称ZO-1)是膜相关鸟苷酸激酶同系物家族的成员,通过上皮表型相关基因和上调间质细胞表型相关基因来调控EMT相关基因的转录,参与促进细胞分化和迁移并与癌症干细胞表型相关[18]。细胞-细胞连接蛋白在维持组织结构中起着至关重要的作用,但在不同的癌症中通常会失调。越来越多的研究表明TJP1表达下调与癌症扩散和转移增强相关[19],例如TJP1可以促进胃癌细胞的增殖和运动[20]。最近的研究表明TJP1定位于突出的板状伪足和细胞后部细胞接触位点的基部[21],表明TJP1可能对牵引力和拉力之间的相互作用很重要。通过与TJP1蛋白相互作用动态调控E-cadherin表达和定位是阐明癌症转移集体迁移机制的关键因素,这也与本研究结果一致。数据库分析结果显示TJP1在OSCC中下调,miR-191-5p的下调增加了TJP1蛋白的表达水平,抑制了口腔鳞癌细胞的侵袭性。本实验为了验证TJP1的作用,将siRNA-TJP1转染到miR-191-5p低表达的细胞中,同时下调TJP1后Cal-27细胞的增殖和侵袭迁移显著增强,表明下调TJP1可以逆转敲低miR-191-5p对Cal-27细胞增殖和迁移的抑制作用。

综上所述,miR-191-5p在口腔鳞状细胞癌中高表达,体外下调miR-191-5p可显著抑制OSCC细胞增殖侵袭迁移和EMT形成,miR-191-5p可通过靶向紧密结合蛋白TJP1发挥这一功能。由于实验条件有限仅使用一种OSCC细胞开展研究,本研究需要进一步探索miR-191-5p对其他口腔鳞癌细胞的影响以及其他靶标的潜在机制。尽管这只是一项临床前研究,我们的研究结果为口腔鳞状细胞癌治疗提供了一些线索,但实验结果和在临床实践中的有效应用需要进一步验证。未来需要深入探究miR-191-5p对口腔鳞状细胞癌的临床影响,以证实当前发现在临床实践中的临床相关性。