桦褐孔菌醇提物对胃癌模型裸鼠和BGC-823胃癌细胞Ras/MAPK信号通路的影响

乔羽，项楠，周忠光，刘旭

（黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040）

胃癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一［1］，预后相对较差，严重威胁人类健康［2］。中国是胃癌高发国家［3］，发病率位居全球第五，病死率位居全球第三［4］，疾病负担严重，是我国癌症防治的重点［5］。然而，大部分胃癌被发现时已处于晚期，错过了最佳手术治疗时间［6］，加上对放疗化疗不敏感，治疗效果很难尽如人意［7］。近年来，通过阻断致癌的分子信号通路，从而逆转癌症的发生、发展、阻滞癌细胞的转移，成为胃癌研究的焦点。研究表明，激活裸鼠的K-Ras基因，可以激活MAPK信号途径，从而引起前胃鳞状上皮细胞的过度增殖和胃腺体的化生［8］。因此，笔者选择Ras/MAPK信号通路作为切入点，研究桦褐孔菌醇提物对该信号通路的影响，为寻找胃癌的潜在治疗靶点和药物的开发奠定基础。

1 材料

1.1 实验动物

雄性裸鼠49只，由黑龙江中医药大学实验动物中心提供，实验动物质量合格证号：SCXK（京）2016-0006，3～5周龄，体质量（20±2）g，清洁级饲养，自由摄入水和饲料，适应性喂养一周后开始实验。

1.2 瘤株

人系胃癌细胞株BGC-823由中科院上海细胞所提供。

1.3 药物

桦褐孔菌由黑龙江儒泰科技发展有限责任公司提供。按照醇提法常规操作，取桦褐孔菌1 kg，加70%乙醇10 L，加盖常温浸泡24 h，100 ℃加热回流1 h提取，得到滤液1，残渣再加70%乙醇，加热回流1 h提取，得到滤液2，合并滤液1与滤液2，水浴箱蒸干，打粉；卡培他滨片（江苏恒瑞医药股份有限公司，国药准字H20133366）；5-FU（索莱宝生物科技有限公司，批号：IF0170）。

1.4 主要仪器与试剂

Ras试剂盒、JNKS试剂盒、p38MAPK试剂盒［爱必信（上海）生物科技有限公司，货号：abs123144、abs131533、abs131944］；PVDF膜（Summus，S59825）；丙烯酰胺（Vetec，V900845）；甲叉双丙烯酰胺（Sigma，146072）；过硫酸铵（Sigma，9913）；SDS、Tween20（Biotopped，货号：S6010、P9416）；TEMED（Sigma，T7024）；Glycine（Sigma，G7126）；TRIS（Sigma，T3253）；PageRuler™Prestained Protein Ladder（Thermo，26616）；Western bloting及IP裂解液（碧云天，P0013）；PMSF（碧云天，ST506）；一抗稀释液（碧云天，P0023A）；一抗二抗去除液（碧云天，P0025）；二抗（中杉，ZB2301）；20XTBS（Solarbio，T1080）；Western专用脱脂奶粉（BD，1174551）；甲醇（天津市富宇精细化工有限公司，2018.6.10）；BeyoECL Plus（碧云天，P0018）。

-80 ℃低温冰箱（日本三洋，MDF-C8V1）；制冰机（Simag，SPR80）；超纯水仪（美国密理博，Milli-Q）；凝胶成像系统（美国UVP，MegaCam815）；低温离心机（德国Sigma，4-16S）；高速离心机（上海安亭，TGL-20B）；电子恒温水浴锅（天津泰斯特仪器有限公司，DK98-1）；普通PCR仪（北京东胜创新生物科技有限公司，ETC811）；水平电泳系统（北京六一，DYCP-31CN）；精密天平（瑞士赛多利斯，BSA124S）；酸度计（美国奥德龙，StartA2117）；紫外分光光度计（日本岛津，UV-2401）；荧光定量PCR（美国ABI，7500）；PH复合电极棒（梅特勒-托利多，LP115）；磁力搅拌器（金城国胜实验仪器厂，78-1）；SDS电泳仪（Bio-Rad，042BR13724）；微量光吸收仪（Implen，p330）；转膜仪（Bio-Rad，221BR52130）；垂直凝胶电泳槽（Bio-Rad，552BR113758）；凝胶成像系统（Bio-Rad，Universal hood Ⅱ）；脱色摇床（沃德生物医学仪器公司，WD-9405B）；全自动图像分析系统（TANON，5020）。

2 方法

2.1 体内实验

2.1.1 动物分组及模型制备

49只雄性裸鼠随机分为空白组、模型组、阴性对照组、西药组和桦褐孔菌醇提物高、中、低剂量组。除空白组外，其余6组在每只裸鼠腋下皮肤接种0.2 mL BGC-823细胞（2 × 107个/mL）。每天观察肿瘤形成情况，第7天开始可在皮下触及粟粒样肿瘤，所有裸鼠模型均制备成功。

2.1.2 给药

桦褐孔菌醇提物高、中、低剂量组给予羧甲基纤维素钠（CMC）溶解的桦褐孔菌醇提物1.56、0.78、0.39 mg/g；西药组药物依据临床应用，选用抗消化道肿瘤常用口服药物卡培他滨片，剂量经人鼠等效剂量折算确定为0.5 mg/g，每只裸鼠灌胃给药0.3 mL；阴性对照组只给予CMC溶剂；空白组和模型组不给药，每日1次，连续21 d。

2.2 体外实验

2.2.1 细胞培养

用90%RPMI-1640，10%胎牛血清和1%双抗制作培养液、用于人系胃癌细胞株BGC-823的培养。

2.2.2 体外实验分组在肿瘤细胞BGC-823的对数生长期，用胰酶消化，调整细胞浓度为5 × 104个/mL。随机分为模型组、阴性对照组、西药组、高剂量组、中剂量组和低剂量组。模型组给予同体积培养液，阴性对照组给予同体积二甲基亚砜，西药组给予5-氟尿嘧啶（5-Fu）120 mg/mL，高、中、低剂量组分别给予褐孔菌醇提物0.4、0.2、0.1 mg/mL。

2.3 检测指标与方法

2.3.1 免疫组化法检测肿瘤组织Ras、JNKS、p38MAPK给药21 d后，取肿瘤组织用多聚甲醛溶液固定，采用免疫组化法检测Ras/MAPK通路上下游相关因子Ras、JNKS、p38MAPK的表达水平。切片、65 ℃烘片2 h、脱蜡、水化、滴加3% H2O2，静置10 min，把切片放入枸橼酸钠溶液中，微波修复，冷却至室温37 ℃，滴加山羊血清封闭10 min、滴加一抗，装入湿盒，放入冰箱4 ℃过夜，次日37 ℃复温45 min，滴加二抗试剂1，37 ℃孵育15 min，滴加二抗试剂2，37 ℃孵育15 min，加DAB试剂显色，镜下观察，随时清洗，苏木复染，盐酸酒精分化，梯度醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，400倍镜下观察并拍照。

2.3.2 荧光定量PCR检测肿瘤细胞Raf-1、MEK、ERKs、p38MAPK的基因表达

设计与合成引物，扩增的片段长度为100～300 bp，提取总RNA，反转录，65 ℃（1 min）→30 ℃（5 min）→65 ℃（25 min）→98 ℃（5 min）→5 ℃（5 min）从30 ℃升温到65 ℃时，必须15～30 min内匀速升温。两步法PCR扩增标准程序：预变性95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃34 s 40个循环。引物序列见表1。

表1 PCR引物序列

2.3.3 Western blot检测p-Raf-1、p-MEK、p-ERKs、p-p38MAPK蛋白表达

称取样品100 mg置于裂解液中冰上裂解，30 min后离心10 min，取中间层。按照SDS-PAGE凝胶试剂盒说明书操作完成分离胶的配制，插入齿梳水平放置约15 min，将蛋白样品用移液枪注入泳道，每孔上样10 μL，接通电泳仪。结束电泳，取下玻璃板，切取分离胶，于转膜液中平衡10 min。自下而上依次放置平衡过的厚滤纸，PVDF膜，分离胶，厚滤纸，接通电源进行转膜。转膜结束后，将PVDF膜移入盛有TBST缓冲液的平皿中，用TBST洗涤两次，每次10 min。移膜至盛有封闭液的平皿中，置水平摇床上，封闭2 h。封闭结束后，将PVDF膜用TBST洗涤两次，每次10 min。之后将膜放入杂交袋中，置入4 ℃冰箱过夜。次日，移至盛有TBST液的平皿中，洗涤4次，每次10 min，将膜及二抗液封入杂交袋中，水平摇床上摇动，室温下孵育1 h，洗脱二抗。滤纸吸干液体，ECL发光液滴注于PVDF膜上，约1 min后曝光，保存图像。

2.4 统计学方法

采用SPSS 26.0软件进行统计学处理，多组间连续变量采用单因素方差分析（OneWay ANOVA），数据均以±s表示，以P＜ 0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 各组裸鼠肿瘤组织Ras、JNKS、p38MAPK的表达情况

模型组和阴性对照组Ras阳性表达强，西药组和桦褐孔菌醇提物高剂量组Ras阳性表达弱，桦褐孔菌醇提物中、低剂量组Ras阳性表达高于西药组和桦褐孔菌醇提物高剂量组，低于模型组。见图1。

图1 各组肿瘤组织Ras的表达情况（× 400）

模型组和阴性对照组JNKS阳性表达强，西药组JNKS阳性表达最弱，桦褐孔菌醇提物高、中、低剂量组JNKS阳性表达高于西药组，低于模型组。见图2。

图2 各组肿瘤组织JNKS的表达情况（× 400）

模型组和阴性对照组p38MAPK阳性表达强，西药组p38MAPK阳性表达弱，桦褐孔菌醇提物高、中、低剂量组p38MAPK阳性表达高于西药组，低于模型组。见图3。

图3 各组肿瘤组织p38MAPK的表达情况（× 400）

与模型组比较，西药组与桦褐孔菌醇提物高、中、低剂量组Ras、JNKS、p38MAPK蛋白的阳性表达降低，差异有统计学意义（P＜ 0.01）。见表2。

表2 各组肿瘤组织Ras、JNKS、p38MAPK表达水平比较（±s）

表2 各组肿瘤组织Ras、JNKS、p38MAPK表达水平比较（±s）

注：与模型组比较，*P ＜ 0.01。

p38MAPK 0.529±0.395 0.550±0.380 0.145±0.009*0.182±0.175*0.313±0.283*0.419±0.277*组别模型组阴性对照组西药组桦褐孔菌醇提物高剂量组桦褐孔菌醇提物中剂量组桦褐孔菌醇提物低剂量组n6 6 6 6 6 6 Ras 0.365±0.018 0.365±0.018 0.079±0.011*0.106±0.008*0.148±0.017*0.231±0.014*JNKS 0.351±0.020 0.352±0.013 0.292±0.012*0.107±0.011*0.178±0.014*0.218±0.017*

3.2 PCR检测BGC-823肿瘤细胞Raf-1、MEK、ERKs、p38MAPK的基因表达

与模型组比较，西药组与高、中、低剂量组Raf-1、p38MAPK基因相对表达量降低，差异有统计学意义（P＜ 0.01）；与模型组比较，西药组与高、中剂量组MEK、ERKs基因相对表达量降低，差异有统计学意义（P＜ 0.01）。见表3。

表3 各组Raf-1、MEK、ERKs、p38MAPK基因相对表达量比较（±s）

表3 各组Raf-1、MEK、ERKs、p38MAPK基因相对表达量比较（±s）

注：与模型组比较，*P ＜ 0.01。

p38MAPK 6.058±0.422 5.964±0.537 2.309±0.347*2.919±0.281*3.486±0.316*4.072±0.392*组别模型组阴性对照组西药组高剂量组中剂量组低剂量组n5 5 5 5 5 5 Raf-1 1.271±0.092 1.252±0.082 0.653±0.065*0.814±0.067*0.962±0.074*1.059±0.091*MEK 0.081±0.008 0.079±0.007 0.041±0.004*0.054±0.005*0.063±0.008*0.069±0.005*ERKs 0.159±0.010 0.161±0.012 0.077±0.006*0.104±0.008*0.126±0.006*0.148±0.009

3.3 Western blot检测BGC-823肿瘤细胞p-Raf-1、p-MEK、p-ERKs、p-p38MAPK蛋白表达

与模型组比较，西药组与桦褐孔菌醇提物处理后高、中、低剂量组p-Raf-1、p-MEK、p-ERKs和pp38MAPK表达水平降低，差异有统计学意义（P＜ 0.01）。见表4。

表4 各组p-Raf-1、p-MEK、p-ERKs、p-p38MAPK表达水平比较（±s）

注：与模型组比较，*P ＜ 0.01。

p-p38MAPK/GAPDH 0.889 3±0.034 7 0.896 3±0.020 4 0.146 1±0.009 7*0.189 2±0.005 9*0.573 2±0.024 6*0.785 3±0.011 3*组别模型组阴性对照组西药组高剂量组中剂量组低剂量组n5 5 5 5 5 5 p-Raf-1/GAPDH 6.139 4±0.210 9 5.973 2±0.146 6 1.159 5±0.018 5*1.510 8±0.026 5*2.430 5±0.067 4*3.224 1±0.151 9*p-MEK/GAPDH 3.676 2±0.133 9 3.605 1±0.081 5 0.242 1±0.012 9*0.385±0.005 8*0.907 9±0.023 8*1.677 1±0.042 0*p-ERKs/GAPDH 3.094 6±0.089 4 2.954 9±0.080 0 0.364 6±0.009 9*0.469 6±0.005 0*1.508 5±0.039 5*2.296 4±0.033 1*

与模型组比较，桦褐孔菌醇提物处理后低、中、高剂量组和西药组p-Raf、p-MEK、p-ERKs和pp38MAPK的蛋白表达逐渐减少，而Raf、MEK、ERK蛋白水平保持不变。见图4。

图4 各组p-Raf-1、Raf-1、p-MEK、MEK、p-ERKs、ERKs、p-p38MAPK蛋白表达图

4 讨论

本研究采用体内与体外实验相结合的方式进行。体内实验采取免疫组织化学法检测桦褐孔菌醇提物治疗后的肿瘤中Ras、JNKS、p38MAPK蛋白表达。结果表明，与模型组比较，各给药组肿瘤组织中Ras、JNKS、p38MAPK蛋白的阳性表达降低。Ras的活化是MAPK途径级联反应的第一步［9］，有研究表明，胃癌患者癌组织中Ras的表达明显高于癌旁组织［10］。Ras活化后，与Raf结合，磷酸化后激活MAPK/ERK激酶（MAPK/ERK kinase）1和MAPK/ERK激酶2，MAPK/ERK激酶2活化Erk1和Erk2，移位至细胞核，作用于相关基因，促进RNA的合成，进而调节细胞增殖。JNKS是MAPK家族成员之一，可被炎症因子、氧化损伤等多种因素激活，通过细胞凋亡、氧化应激反应在多种人类疾病的发生与发展过程中起着至关重要的作用［11］。在MAPK家族中，p38激酶在肿瘤中被发现有改变，对肿瘤的形成有负向调控作用［12］。体外实验应用PCR和Western blot检测信号通路中的关键因子Raf-1、MEK、ERKs、p38MAPK。PCR结果表明，给药组的肿瘤细胞中Raf-1、MEK、ERKs和p38MAPK表达水平降低，Western blot结果表明，各给药组p-RAF-1、p-MEK、p-ERKs和p-p38MAPK表达水平降低。以上结果说明桦褐孔菌醇提物可能通过下调Ras、JNK、p38MAPK表达，抑制Ras/MAPK信号通路的活化，从而延缓胃癌病情发展。

桦褐孔菌是一种极具研究价值的药食两用大型真菌，在民间治疗恶性肿瘤已有悠久历史，可明显抑制胃癌，防止肿瘤细胞转移、复发［13］。研究表明，桦褐孔菌提取物对多种恶性肿瘤有抑制作用［14］。课题组前期研究发现桦褐孔菌醇提物在体外可抑制胃癌BGC-823细胞的增殖，体内实验发现其可抑制胃癌荷瘤裸鼠的肿瘤生长速度［15］。本研究首次从Ras/MAPK信号通路角度探讨桦褐孔菌醇提物的抗胃癌作用机制，为桦褐孔菌应用于临床治疗胃癌提供了实验依据，但本研究还存在着一定的局限性，如无法确定提取物中具体哪一种有效成分在发挥作用，实验设计还有待完善，下一步计划加入Ras/MAPK信号通路抑制剂验证桦褐孔菌对胃癌的拮抗作用。