高效液相色谱法同时测定人工牛黄甲硝唑胶囊中甲硝唑和胆红素含量*

陈 路，李 苗，黄金秋，兰 彤，宫立孟△

（1.武汉药品医疗器械检验所·国家药品监督管理局药物制剂质量研究与控制重点实验室，湖北 武汉 430075；2.湖北生物医药产业技术研究院有限公司，湖北 武汉 430073）

人工牛黄甲硝唑胶囊对急性智齿冠周炎、局部牙槽脓肿、牙髓炎牙根炎疗效较好［1-2］。该方主要由人工牛黄和甲硝唑组成，其中人工牛黄主要成分有牛磺酸、牛胆粉、胆红素等，有清热解毒、化痰定惊功效［3-5］。胆红素是制剂质量的评价指标之一。2020 年版《中国药典》暂未收载人工牛黄甲硝唑胶囊的质量标准，本品现行标准为《国家药品标准·化学药品地方标准上升国家标准》，其中甲硝唑与胆红素的含量需分别测定，操作烦琐。且测定甲硝唑含量的紫外- 可见分光光度法专属性不强，易受辅料等杂质干扰；测定胆红素含量的高效液相色谱（HPLC）法，流动相和提取溶剂均用到了三氯甲烷，其对人体有害，且易挥发，在光照条件下易氧化，分解为剧毒的碳酰氢和氯化氢，作为溶剂对液相流路部分有侵蚀效应［6］。鉴于此，本研究中建立了同时测定人工牛黄甲硝唑胶囊中胆红素和甲硝唑含量的HPLC法。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

e2695 型高效液相色谱仪（美国Waters 公司）；SK8200HP 型超声波清洗机（上海科导超声仪器有限公司）；XS205 型电子分析天平（瑞士Mettler Toledo 公司，精度为0.01 mg）；CLXXXUVM2 型纯水机（瑞士Elga公司）。

1.2 试药

人工牛黄甲硝唑胶囊（企业A 1批，批号为201101；企业B3批，批号分别为366201191，366210503，366201061；规格均为每粒含甲硝唑200 mg、人工牛黄5 mg）；甲硝唑对照品（批号为100191 - 201808，含量100.0%），胆红素对照品（批号为100077-202009，含量98.8%），均购自中国食品药品检定研究院；乙腈、甲醇均为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Hypersil BDS C18柱（200 mm×4.6 mm，5µm）；流动相：1%醋酸水溶液（A）- 乙腈（B），梯度洗脱（0～6.0 min 时92%A，6.0～6.1 min 时92%A →2%A，6.1～16.0 min 时2%A，16.0～16.1 min 时2%A →92%A，16.1～22.0 min 时92%A）；流速：1 mL/ min；检测波长：320 nm（甲硝唑）、449 nm（胆红素）；柱温：30 ℃；进样量：10µL（甲硝唑）、5µL（胆红素）。

2.2 溶液制备

对照品溶液：取胆红素对照品适量，精密称定，加二氯甲烷制成含胆红素8 µg/mL 的对照品溶液Ⅰ；取甲硝唑对照品适量，105 ℃干燥2 h，精密称定，加50%甲醇溶解，制成含甲硝唑0.1 mg/mL的对照品溶液Ⅱ。

供试品溶液：取样品适量（约10 粒，相当于人工牛黄50 mg），精密称定，置50 mL 棕色容量瓶中，加提取溶剂［二氯甲烷- 甲醇- 水- 盐酸（90∶10∶0.3∶0.03，V/V/V/V）］30 mL，冰浴超声（功率500 W，频率53 kHz）20 min 使溶解，用提取溶剂定容，滤过，取续滤液，作为供试品溶液Ⅰ。取样品适量（约1 粒，相当于甲硝唑200 mg），精密称定，置200 mL容量瓶中，加50%甲醇振摇使溶解并定容，摇匀，滤过，精密量取续滤液5 mL，置50 mL容量瓶中，用50%甲醇定容，摇匀，作为供试品溶液Ⅱ。

阴性对照品溶液：按人工牛黄甲硝唑胶囊的处方及工艺分别制备缺人工牛黄或甲硝唑的单一阴性样品，按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液Ⅰ和Ⅱ。

2.3 方法学考察

系统适用性及专属性试验：取2.2 项下6 种溶液各适量，按2.1项下色谱条件进样测定，记录色谱图。结果供试品溶液色谱图中，在与对照品溶液色谱图相应位置处有吸收峰。理论板数按胆红素、甲硝唑峰计均不低于3 000，分离度均大于1.5，基线分离良好，且阴性对照无干扰。详见图1。

1.胆红素 2.甲硝唑A1.对照品溶液Ⅰ B1.供试品溶液Ⅰ C1.阴性对照品溶液Ⅰ A2.对照品溶液Ⅱ B2.供试品溶液Ⅱ C2.阴性对照品溶液Ⅱ图1 高效液相色谱图1.Bilirubin 2.MetronidazoleA1.Reference solution Ⅰ B1.Test solution Ⅰ C1.Negative reference solution Ⅰ A2.Reference solution Ⅱ B2.Test solution ⅡC2.Negative reference solution ⅡFig.1 HPLC chromatograms

线性关系考察：取胆红素对照品约10 mg，置100 mL棕色容量瓶中，用二氯甲烷溶解并定容，制成含胆红素98.90 µg/ mL 的对照品贮备液Ⅰ，分别量取适量，稀释，制成含胆红素1.98，3.96，5.93，7.91，9.89，11.87，13.85µg/mL的系列对照品溶液。按2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积，以胆红素质量浓度（X，mg/mL）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程Y1=25 474X1+7 329（r=0.999 9，n=7）。结果表明，胆红素质量浓度在1.98～13.85µg/mL 范围内与峰面积线性关系良好。取甲硝唑对照品适量，105 ℃干燥2 h，精密称定，加50%甲醇溶解，制成含甲硝唑1 006.4µg/mL的对照品贮备液Ⅱ，分别量取适量，稀释，制成含甲硝 唑20.13，50.32，80.51，100.64，120.77，150.96，201.28µg/mL的系列对照品溶液。按2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积，以甲硝唑质量浓度（X，µg/mL）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程Y2= 23 902X2- 59 310（r= 0.999 9，n= 7）。结果表明，甲硝唑质量浓度在20.13～201.28 µg/ mL 范围内与峰面积线性关系良好。

定量限考察：取线性关系考察项下对照品贮备液Ⅰ适量，加二氯甲烷稀释，制成含胆红素0.098 9µg/mL的溶液，按2.1 项下色谱条件进样测定，得胆红素峰的信噪比为9.4，按信噪比10∶1 计算，胆红素定量限为0.10 µg/ mL。取对照品贮备液Ⅱ适量，加50%甲醇稀释，制成含甲硝唑0.040 3 µg/ mL 的溶液，按2.1 项下色谱条件进样测定，得甲硝唑峰的信噪比为7.1，按信噪比10∶1计算，甲硝唑定量限为0.057µg/mL。

精密度试验：取2.2 项下供试品溶液Ⅰ和Ⅱ各适量，按2.1 项下色谱条件连续进样测定6 次，计算峰面积。结果胆红素和甲硝唑峰面积的RSD分别为0.42%和0.21%（n=6），表明方法精密度良好。

稳定性试验：取供试品溶液Ⅰ和Ⅱ各适量，分别在室温下放置0，4，12，16，18，24 h及0，4，8，12，24，36，48 h时按2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果表明，供试品溶液Ⅰ峰面积的RSD为0.82%（n=6），表明其室温放置24 h内稳定性良好；供试品溶液Ⅱ峰面积的RSD为0.40%（n=7），表明其室温放置48 h内稳定性良好。

重复性试验：取样品（批号为201101）内容物适量，各6份，按2.2项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并计算样品含量。结果胆红素、甲硝唑平均含量分别为0.032 mg/ 粒和101.42%，RSD分别为1.00%和0.31%（n=6）。

加样回收试验：取样品（批号为201101）内容物适量，各9 份，精密加入胆红素对照品及甲硝唑对照品适量，按2.2项下方法分别制备胆红素及甲硝唑的供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并计算加样回收率。结果见表1。

表1 加样回收试验结果（n=9）Tab.1 Results of the recovery test（n=9）

2.4 样品含量测定

取B 企业3 批样品各适量，分别按2.2 项下方法制备供试品溶液，再分别按2.1项下色谱条件及法定方法进样测定，记录峰面积，并计算含量。结果见表2。

表2 样品含量测定结果（n=3）Tab.2 Results of content determination of bilirubin and metronidazole in samples（n=3）

3 讨论

3.1 流动相选择

目前，现行标准和文献中规定胆红素的流动相中均含有三氯甲烷［7-8］，且仅针对胆红素的检测。三氯甲烷为易制毒物且对环境污染大，故本研究中对流动相进行优化，采用对环境伤害较小的1%醋酸水溶液-乙腈（5∶95，V/V）代替原有含三氯甲烷的流动相，同时兼顾了甲硝唑的检测。经反复试验，本研究中最终在该流动相基础上采用梯度洗脱，2个组分均在合理的时间范围内洗脱。

3.2 波长和溶剂选择

由于甲硝唑和胆红素最大吸收波长相差较大，故采取双波长检测。结合甲硝唑和胆红素扫描图谱和现行标准，确定甲硝唑检测波长为320 nm，胆红素检测波长为449 nm。参考2020 年版《中国药典》中甲硝唑胶囊的现行标准，甲硝唑提取溶剂采用50%甲醇。结合型胆红素由胆红素蛋白和钙元素聚合而成，难溶于水和有机溶剂［9-10］。游离胆红素的分子结构为折叠型，故易在二氯甲烷、苯、三氯甲烷等有机溶剂中溶解，为了将结合型胆红素解离转化为游离胆红素，多用酸作为解离剂［11-12］。故胆红素多用三氯甲烷和酸组合来提取。据报道，在提取溶剂中加入甲醇对样品的渗透性较好，且能提高提取效率［13-14］。因二氯甲烷毒性低于三氯甲烷，预试验中考察了不同比例二氯甲烷和甲醇的提取效率及参考现行标准，确定了二氯甲烷- 甲醇- 水-盐酸（90∶10∶0.3∶0.03，V/V/V/V）为提取溶剂。

3.3 进样量选择

预试验中在进样量为10µL 时，胆红素浓度较高时峰形欠佳，柱效过低，当进样量≤5 µL 时峰形良好。另外，不同来源的人工牛黄中胆红素含量差异较大，为适应检测需求，将进样量设为5µL。

3.4 方法评价

本研究中建立了可同时测定人工牛黄甲硝唑胶囊中甲硝唑和胆红素含量的HPLC 法。该方法与制剂法定标准检测结果相近，且改进了甲硝唑的检测方法，优化了胆红素的提取溶剂。所建立的方法准确度高、重复性好，可用于本品中2 个有效成分的同时测定与质量控制，也为其他含牛黄制剂的测定提供了参考。