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扁蕾颗粒质量标准提升研究*

2023-12-01石春兰刘学良俞雅琼年永琪王永晶韩达斌刘海青

中国药业 2023年22期
关键词:草素木犀甲氧基

石春兰,刘学良,俞雅琼,陈 鹏,年永琪,王永晶,韩达斌,刘海青

(青海省药品审评核查中心,青海 西宁 810007)

扁蕾颗粒是由湿生扁蕾药材经提取制成的单方制剂,有清热燥湿、利湿干黄水功效,临床主要用于治疗小儿腹泻、肠胃炎[1-5]。其收载于《卫生部药品标准·蒙药分册》[6],质量标准中仅有性状及制剂通则项下规定的检查项,不能有效控制药品质量。为了更全面地控制扁蕾颗粒质量,本试验中采用薄层色谱(TLC)法对制剂中1,7 - 二羟基- 3,8 - 二甲氧基酮进行定性鉴别,同时采用高效液相色谱(HPLC)法测定组方药材有效成分当药苷、木犀草素、1,7-二羟基-3,8-二甲氧基酮的含量。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters 2695 型高效液相色谱仪,包括Waters 2998 PDA detector 型二极管阵列检测器(美国Waters 公司);ME204 型电子天平(梅特勒- 托利多仪器<上海>有限公司,精度为0.1 mg);XS105DU 型分析天平(瑞士Mettler Toledo公司,精度为0.01 mg);SB25-12DT型超声波清洗机(宁波新芝生物科技股份有限公司);Milli-Q2355型超纯水机(美国Millipore公司)。

1.2 试药

扁蕾颗粒(三普药业有限公司,批号分别为190702,190703,190704,191002,191003);木犀草素对照品(批号为111720-202111,含量99.1%),当药苷对照品(批号为111742 - 200501,含量99.27%),均购自中国食品药品检定研究院;1,7 - 二羟基- 3,8 - 二甲氧基酮对照品(含量>96%),由中国科学院西北高原生物研究所孙洪发研究员提供;硅胶G 预制薄层板,硅胶GF254薄层板(青岛海洋化工有限公司);甲醇、磷酸均为色谱纯,其余试剂均为分析纯;水为超纯水;湿生扁蕾对照药材,采集于青海省海东市互助县,由青海省药品审评核查中心刘海青主任药师鉴定为正品。

2 方法与结果

2.1 TLC 鉴别[7-9]

分别取5 批次扁蕾颗粒样品各适量,置研钵研细,各取约4 g,转移至具塞锥形瓶中,加甲醇50 mL,超声(功率350 W,频率35 kHz)处理30 min,滤过,水浴蒸干,残渣加2 mL 甲醇使溶解,作为供试品溶液。另取1,7 - 二羟基- 3,8 - 二甲氧基酮适量,分别加甲醇制成每1 mL 含1 mg 的对照品溶液。按扁蕾颗粒处方及工艺制备缺扁蕾的阴性样品,并按供试品溶液制备方法制得阴性对照品溶液。取湿生扁蕾对照药材4 g,加甲醇25 mL,超声(功率350 W,频率35 kHz)处理30 min,滤过,水浴蒸干,残渣加2 mL 甲醇使溶解,作为对照药材溶液。按2020 年版《中国药典(四部)》通则0502 薄层色谱法,吸取上述溶液各5µL,分别点于同一硅胶G 薄层板上,以正己烷- 乙酸乙酯- 冰醋酸(8∶1.5∶0.25,V/V/V)为展开剂,展开,取出,晾干,喷以1%三氯化铝乙醇溶液,105 ℃下加热数分钟,置紫外光灯(365 nm)下检视。结果对照品溶液色谱中,在与供试品溶液色谱相应位置显相同斑点,且阴性对照无干扰。详见图1。

2.2 含量测定

2.2.1 色谱条件

色谱柱:Waters SunFire C18柱(250 mm × 4.6 mm,5 µm);流动相:甲醇(A)- 0.05 %磷酸水溶液(B),梯度 洗 脱(0~5 min 时20%A →25%A,5~7 min 时25%A,7~30 min 时25%A →55%A,30~35 min 时55%A →90%A);流速:1.0 mL/min;检测波长:254 nm;柱温:30 ℃;进样量:10µL[10-15]。

2.2.2 溶液制备

混合对照品溶液:取当药苷对照品8.10 mg,木犀草素对照品5.71 mg,1,7-二羟基-3,8-二甲氧基酮对照品7.81 mg,精密称定,分别置10,10,50 mL容量瓶中,加甲醇溶解并定容,摇匀,作为对照品贮备液;分别取5,2,2 mL,置同一20 mL容量瓶中,加甲醇溶解并定容,摇匀,即得当药苷、木犀草素、1,7-二羟基-3,8-二甲氧基酮质量浓度分别为0.201 0,0.056 6,0.015 0 mg/mL的混合对照品溶液。

供试品溶液:取样品适量,研细,取约0.5 g,精密称定,置锥形瓶中,精密加入甲醇25 mL,称定质量,超声(功率250 W,频率50 kHz)处理30 min,放冷,再次称定质量,用甲醇补足减失的质量,摇匀,滤过,取续滤液,即得。

阴性对照品溶液:按扁蕾颗粒工艺和处方制备不含湿生扁蕾药材的阴性样品,并按供试品溶液制备方法制备,即得。

2.2.3 方法学考察[16-19]

系统适用性试验及专属性试验:精密吸取2.2.2项下3种溶液各10µL,按2.2.1项下色谱条件进样测定,记录色谱图,并采用外标法计算进样量和峰面积。结果各待测成分分离良好,阴性对照无干扰,理论板数以待测成分峰计均不低于3 000,分离度均大于1.5。详见图2。

1.当药苷 2.木犀草素 3.1,7 - 二羟基- 3,8 - 二甲氧基酮A.混合对照品溶液 B.供试品溶液 C.阴性对照品溶液图2 高效液相色谱图1.Sweroside 2.Luteolin 3.1,7 - Dihydroxy - 3,8 -dimethoxyxanthoneA.Mixed reference solution B.Test solution C.Negative reference solutionFig.2 HPLC chromatograms

线性关系考察:分别取当药苷、木犀草素、1,7-二羟基-3,8-二甲氧基酮对照品41.26,14.08,7.81 mg,精密称定,分别加甲醇溶解,制成当药苷质量浓度分别 为0.020 5,0.041 0,0.102 4,0.204 8,0.307 2,0.409 6 mg/mL,木犀草素分别为0.005 6,0.011 2,0.027 9,0.055 8,0.083 7,0.111 6 mg / mL,1,7 - 二羟基-3,8 - 二甲氧基酮分别为0.001 5,0.003 0,0.007 5,0.015 0,0.022 5,0.030 0 mg/mL的系列混合对照品溶液,按2.2.1 项下色谱条件进样测定,以待测成分质量浓度(X,mg/mL)为横坐标、峰面积(Y)为纵坐标进行线性回归,得回归方程,当药苷Y1= 13 095 403.87X1+54 113.68(r=0.999 6),木犀草素Y2=25 617 524.61X2+2 368.70(r= 0.999 8),1,7 - 二 羟 基 - 3,8 -二甲氧基酮为Y3= 67 491 848.93X3- 2 666.99(r=0.999 7)。结果表明,当药苷、木犀草素、1,7-二羟基- 3,8 - 二甲氧基酮质量浓度分别在0.020 5~0.409 6 mg/ mL、0.005 6~0.111 6 mg/ mL、0.001 5~0.030 0 mg/mL范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验:精密吸取混合对照品溶液(木犀草素、当药苷、1,7-二羟基-3,8-二甲氧基酮质量浓度分别为0.056 6,0.201 0,0.015 0 mg/ mL)10 µL,按2.2.1项下色谱条件连续进样测定6次,记录峰面积。结果当药苷、木犀草素、1,7-二羟基-3,8-二甲氧基酮峰平均峰面积的RSD分别为0.26%,0.16%,0.27%(n=6),表明仪器精密度良好。

稳定性试验:取2.2.2 项下供试品溶液适量,分别于室温下放置0,2,8,16,24 h时按2.2.1项下色谱条件进样测定,记录峰面积。结果当药苷、木犀草素、1,7-二羟基- 3,8 - 二 甲 氧基酮峰峰面积的RSD分别为0.22%,0.04%,0.79%(n=5),表明供试品溶液在室温下放置24 h内基本稳定。

重复性试验:取样品(批号为190702)6份,按2.2.2项下方法制备供试品溶液,按2.2.1项下色谱条件进样测定,记录峰面积,并计算含量。结果当药苷、木犀草素、1,7 - 二羟基- 3,8 - 二甲氧基酮平均含量分别为8.30,1.06,0.74 mg/ g,RSD分别为1.06%,0.42%,0.92%(n=6),表明方法重复性良好。

加样回收试验:取样品(批号为190702)0.5 g,研细,精密称定,取6 份,置锥形瓶中,均分别精密加入2.2.2 项下当药苷对照品溶液(0.819 2 mg/ mL)5.0 mL,木犀草素对照品溶液(0.558 1 mg / mL)1.0 mL,1,7 - 二羟基- 3,8 - 二甲氧基酮对照品溶液(0.150 0 mg/mL)2.5 mL,按2.2.2项下方法制备供试品溶液,按2.2.1项下色谱条件进样测定,记录峰面积,并计算加样回收率。结果见表1。

表1 加样回收试验结果(n=6)Tab.1 Results of the recovery test(n=6)

2.2.4 样品含量测定

取5 批样品各约0.5 g,精密称定,按2.2.2 项下方法制备供试品溶液,再按2.2.1 项下色谱条件进样测定,记录色谱图,并计算样品含量。结果见表2。

表2 样品含量测定结果(n=3)Tab.2 Results of content determination of three components in samples(n=3)

3 讨论

3.1 指标成分选择

3.2 TLC 鉴别试验条件

TLC鉴别研究过程中,针对不同的(极性)提取溶剂(甲醇、乙醇、水),提取方法(超声、回流、冷浸),提取时间(20,30,40 min),展开剂[环己烷-乙酸乙酯-甲酸(8∶9∶0.5)、正己烷-乙酸乙酯-冰醋酸(8∶9∶0.2)、正己烷-乙酸乙酯-甲酸(12∶13.5∶1.5)、甲苯-乙酸乙酯-甲酸(5∶4∶1)、甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(10∶6∶1∶0.7)、三氯甲烷- 甲醇- 甲酸(7∶2∶0.5)、三氯甲烷- 甲醇- 水(15∶5∶1.5),比例均为体积比],不同薄层板(硅胶G薄层板、硅胶GF254薄层板)进行了考察。根据色谱分离效果、斑点显色结果,最终确定了本试验中的样品制备方法和薄层色谱展开条件,该条件下样品分离良好,斑点清晰,重复性较好。

3.3 样品含量测定提取方法

预试验中比较了超声和回流提取法对3 种待测成分提取率的影响,结果无显著差异,且前者更简便,故选择超声提取。比较了不同提取溶剂(水、甲醇、70%乙醇、95%乙醇、三氯甲烷),提取时间(20,30,40 min)和提取量(25,50 mL)对3种待测成分提取率的影响,最终确定了本试验中的供试品溶液制备方法。国家药品监督管理局官网检索结果显示,扁蕾颗粒仅1 家企业生产,收集到的5 批样品含量测定结果基本接近,说明生产企业在原材料、生产工艺等方面控制较好。

3.4 方法评价

本研究中建立的有效成分的TLC 定性鉴别方法及测定3 种主要有效成分含量的HPLC 法,方法简便、高效,结果准确,能为扁蕾颗粒的质量控制提供参考。

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