柔弱斑种草石油醚部位化学成分活性研究*

夏 炎，商 勋，赵小超△，廖承谱，丁美婷，王 勇

（1.江苏省南京市中西医结合医院，江苏 南京 210000； 2.江苏省宿迁市中医院，江苏 宿迁 223800；3.浙江大学金华研究院，浙江 金华 321000）

肺癌死亡率居癌症之首［1］。在治疗过程中，多种因素可诱发肺癌及其他癌症患者的肺部感染［2-3］，甚至危及生命，而中药可在肺癌的治疗中发挥重要作用。柔弱斑种草Bothriospermum zeylanicum（J.Jacquin）Druce 归肺经，具有止咳等功效［4-5］，收载于《中药大辞典》《中华本草》等典籍。本研究中采用气相色谱质谱联用（GC -MS）法初步分析柔弱斑种草石油醚部位（PB）的化学成分，再通过微量肉汤稀释法和MTS 法探讨其抗菌及抗肺癌活性，并采用网络药理学分析挖掘其抗肺癌的潜在分子机制，为其深入开发与利用提供参考。

1 仪器、试药与菌株、细胞

1.1 仪器

8860 - 5977B 型气相色谱- 质谱联用仪（美国Agilent 公司）；UV2550 型紫外可见-分光光度计（日本Shimadzu 公司）；XS205 型分析天平（意大利Mettler Toledo 公司）；RE-52A A 型旋转蒸发器、SHB-Ⅲ型真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；CA-1115A型冷却水循环装置（上海爱朗仪器有限公司）；DMI3000B 型倒置显微镜（德国Leica 公司）；370 系列CO2培养箱、Multiskan FC型酶标仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）。

1.2 试药

头孢他啶（齐鲁制药有限公司，批号为1H0189A50）；青霉素G钠（华北制药股份有限公司，批号为F1078101）；顺铂（美仑生物科技有限公司，批号为N1001A）；MH 肉汤（批号为1103531）、LB 肉汤（批号为1096071），均购自广东环凯微生物科技有限公司；胎牛血清（批号为1706126），RMPI - 1640 培养基（批号为0023019），DMEM 培养基（批号为0024719），胰酶（批号为0023518），双抗（批号为1936917），磷酸盐缓冲液（PBS，批 号 为0044818），二 甲 基 亚 砜（DMSO，批 号 为B821BA0018），均购自碧艾（上海）生物科技有限公司；MTS 试剂盒（美国Promega 公司，批号为0000219904）；95% 乙醇、石油醚（60～90 ℃）、甲醇、无水乙醇等均为分析纯，水为超纯水。柔弱斑种草药材样品，采于江苏省宿迁市宿豫区曹集田间，经广西壮族自治区中医药研究院黄云峰副研究员鉴定为正品。

1.3 菌株与细胞

大肠埃希菌Escherichia coli（ATCC25922）、金黄色葡萄球菌金黄亚种Staphylococcus aureussubsp.aureus（ATCC29213）、肠沙门氏菌肠亚种Salmonella entericasubsp.enterica（ATCC14028）、铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa（ATCC27853）；人白血病细胞HL-60、肺癌细胞A549、肝癌细胞SMMC - 7721、乳腺癌细胞MCF - 7、结肠癌细胞SW480。均购自中国普通微生物菌种保藏管理中心。

2 方法与结果

2.1 样品制备

取柔弱斑种草药材样品适量，剪段，加10倍量甲醇回流提取3次，减压回收溶剂，合并浓缩物得总浸膏。采用系统溶剂法萃取，浓缩，得PB；取100 mg，加入100 mL锥形瓶内进行甲酯化反应［6］，加石油醚（60～90 ℃）-苯（1∶1，V/V）18 mL，充分溶解，再加0.4 mol/L 氢氧化钾- 氢氧化镁溶液9 mL，50 ℃水浴30 min，加18 mL水，振摇，静置分层，取上清液，加无水硫酸钠脱水，滤过，取滤液，即得样品。

2.2 GC-MS 试验

色谱条件：色谱柱为DB-WAX UI毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.25µm）；固定相为聚乙二醇（PEG-20M）；进样口温度为250 ℃；检测器温度为250 ℃；进样量为1µL；分流比为10∶1；载气为氦气，恒流模式，流速为3.5 mL/ min；尾吹气流速为20 mL/ min；空气流速为450 mL/ min；氢气流速为40 mL/ min；升温程序，初始温度为40 ℃，保持3 min 后以3 ℃/ min 的速率升至250 ℃，保持30 min。

质谱条件：电离方式为电子轰击离子（EI）源；电子能量70 eV，离子源温度230 ℃，四极杆温度150 ℃，传输线温度250 ℃，质量范围35～500 amu；相对含量采用色谱峰面积归一化法计算；主要成分的定性鉴定采用美国国家标准与技术研究院标准质谱谱库（NIST11 谱库）检索法。

方法学考察结果：按相关要求进行方法学考察，结果精密度、稳定性、重复性试验结果的RSD均小于2.0%，表明仪器精密度良好，供试品溶液在室温放置12 h内基本稳定，方法重复性良好。

检测结果：取样品适量，按GC-MS 试验条件进样测定，记录总离子流图（见图1）。PB 的化学成分鉴定结果见表1。共鉴定出30 个化学成分，即亚油酸（20.13%）、十六酸（19.87%）、α-亚麻酸（13.60%）、反油酸（7.23%）、硬脂酸（4.27%）等，主要包含脂肪酸、脂肪醇、酯类、醚类、烷胺类化学成分。

图1 总离子流图Fig.1 Total ion chromatograms

2.3 体外抗菌活性筛选

溶液制备：取样品适量，以DMSO 和PBS为溶剂，灭菌，用水定容，制成质量浓度分别为128.00，100.00，20.00，4.00，0.80，0.16µg/mL 的供试品溶液。取青霉素G 钠适量，以DMSO 和PBS 溶解制成质量浓度分别为5，10µg/mL 的阴性对照溶液，同法制备头孢他啶质量浓度为2µg/mL的阴性对照溶液。

抗菌活性筛选：采用微量肉汤稀释法［7］。以含2%葡萄糖的RMPI-1640 培养基，于37 ℃、5%CO2条件下培养，得浓度为1 × 106cfu/mL 的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌金黄亚种、肠沙门氏菌肠亚种、铜绿假单胞菌菌悬液。实验设PB 组（32，64，128µg/mL）及阳性对照1，2，3组（青霉素G钠5µg/mL、青霉素G钠10µg/mL、头孢他啶2 µg / mL）；取菌悬液及相应药物各100 µL，96 孔板中37 ℃培养24 h，酶标仪测定625 nm 波长处的吸光度（OD）值。重复操作3次。结果质量浓度为128µg/mL时，PB对4 种菌株均无明显抑制作用。详见表2。

表2 抗菌活性筛选结果（±s，%，n=3）Tab.2 Results of antibacterial activity screening（±s，%，n=3）

表2 抗菌活性筛选结果（±s，%，n=3）Tab.2 Results of antibacterial activity screening（±s，%，n=3）

组别质量浓度（µg/mL）抑制率大肠埃希菌肠沙门氏菌肠亚种铜绿假单胞菌阳性对照1组阳性对照2组阳性对照3组PB组5.00 10.00 2.00 128.00金黄色葡萄球菌金黄亚种100.11±0.00 99.94±0.08 99.29±0.00-34.30±3.65-200.31±0.86-26.30±0.39 100.55±0.21-21.60±3.93

2.4 体外抗肿瘤活性筛选

采 用MTS 法［8］。以 含10% 胎 牛 血 清 的 培 养 液（DMEM 或RMPI- 1640）37 ℃培养细胞12～24 h，分别制得HL - 60，A549，SMMC - 7721，MCF - 7，SW480 细胞悬液。以每孔3 000～15 000 个细胞100 µL 接种于96孔板，分别以100.00，20.00，4.00，0.80，0.16µg/mL的样品（每孔100µL）37 ℃下培养48 h。弃去培养液，每孔加入MTS 溶液20 µL 和培养液100 µL，37 ℃下继续孵育2～4 h。以酶标仪测定492 nm 波长处的OD值。以质量浓度（X，µg/mL）为横坐标、细胞存活率（Y）为纵坐标绘制细胞生长曲线，并计算半数抑制浓度（IC50）。实验设阳性对照（顺铂，配制方法与同量同样品）、模型对照、空白对照。细胞增殖抑制率（%）=［1 -（OD给药-OD空白对照）/（OD模型对照-OD空白对照）］×100%。结果显示，PB 对A549 和SMMC-7721细胞增殖具有较明显的抑制作用（见表3），随着样品质量浓度的增大，对2 种细胞增殖的抑制作用也逐渐增强（见图2）。

表3 抗肿瘤活性筛选结果（±s，μg/mL）Tab.3 Results of antitumor activity screening（±s，μg/mL）

表3 抗肿瘤活性筛选结果（±s，μg/mL）Tab.3 Results of antitumor activity screening（±s，μg/mL）

处理方式样品顺铂IC50 HL-60细胞＞100 6.25±0.14 A549细胞76.43±11.33 7.47±0.5 SMMC-7721细胞47.20±7.67 6.06±0.24 MCF-7细胞＞100 73.95±6.06 SW480细胞＞100 28.74±1.93

图2 石油醚部位对肿瘤细胞增殖的抑制作用Fig.2 Inhibitory effect of PB on the proliferation of tumor cells

2.5 抗肺癌作用分子机制研究

共有靶点预测：通过中草药系统药理学平台TCMSP（https：// old.tcmsp - e.com/ tcmsp.php）、中医药综合数据库TCMID（http：//www.megabionet.org/tcmid/）、Batman - TCM 数据库（http：// bionet.ncpsb.org.cn/batman - tcm/）收集并预测PB 的化学成分靶点，以“lung cancer”为关键词，通过GeneCards 数据库（https：//www.genecards.org/）、OMIM数据库（https：//omim.org/）、DisGeNET数据库（https：//www.disgenet.org/）、TTD数据库平台（https：// db.idrblab.net/ ttd/），获得疾病相关靶点。利用Venny 2.1.0软件获得共有靶点。

共筛选出23 727 个疾病靶点，513 个药物靶点，获得共有靶点504个，详见图3。

图3 药物-疾病靶点维恩图Fig.3 Venn diagram of drug - disease targets

富集分析：利用Bioconductor 软件，借助clusterprofiler 包、pathview 包、Dose 包，通过R 4.4.1 软件进行基因本体论（GO）功能富集和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析，以P＜0.01 为筛选阈值，并绘制气泡图。GO功能富集分析筛选出343个条目（P＜0.05），主要包括核受体活性、配体激活的转录因子活性、神经递质受体活性等，详见图4。KEGG通路富集分析筛选出163 条信号通路，主要包括神经活性配体-受体相互作用、钙信号通路、TRP通道的炎症介质调节等通路，其中EGFR，PI3K - Akt，VEGF 等通路在抗肺癌过程中有重要作用，且均有文献证实［9-11］，详见图5。

A.柱状图 B.气泡图图4 GO功能富集分析结果A.Histogram B.Bubble chartFig.4 Results of GO functional enrichment analysis

3 讨论

GC-MS 法共鉴定出PB 中脂肪酸、脂肪醇、酯、醚、烷胺类等30个化学成分，其中亚油酸、十六酸、α-亚麻酸、反油酸、硬脂酸含量较高；抗菌活性筛选实验发现，柔弱斑种草PB 无明显抗菌活性；抗肿瘤活性筛选实验发现，其对A549细胞增殖具有抑制作用，依据其中医药归肺经的药性理论，实验结果结合网络药理学初步探讨了其抗肺癌活性及分子机理，发现PB 可能通过神经活性配体-受体相互作用、EGFR 酪氨酸激酶抑制剂耐药性AGE - RAGE 信号通路、PI3K - Akt 信号通路、VEGF 信号通路等发挥抗肺癌活性。另有研究表明，肉豆蔻酸、十五酸、十六酸、棕榈油酸、油酸、亚油酸、α-亚麻酸等化学成分具有抗肿瘤活性［12-15］，而肉豆蔻酸、十五酸、十六酸、棕榈酸等化学成分对A549细胞增殖具有明显抑制作用，与本研究结果相似，故可为柔弱斑种草PB 具有较强的抗肺癌活性提供依据，提示其作为一种新的、具有抗肺癌活性的中药有较大的开发潜力，需进一步挖掘药效，以更好地服务于临床肿瘤疾病的防治。另外，GC-MS分析表明，PB化学成分中亚油酸相对含量较高，其除具有抗肿瘤活性外，还有较强的抗氧化活性，是天然抗氧化剂的重要原料之一，可降低胆固醇水平，并通过改善脂质代谢和抑制炎性反应缓解非酒精性脂肪性肝病，还可通过调节TLR4/NF- κB信号通路发挥抗类风湿关节炎的作用，对慢性头痛、神经和视网膜功能均有一定作用［16-19］。含量排名第3的α-亚麻酸生物活性多样，主要包括心血管及神经保护、抗癌、抗骨质疏松、抗炎、降糖、抗氧化等作用［15，20-24］。最新研究表明，α- 亚麻酸的足量摄取有助于视网膜DHA 水平提高［25］。表明PB化学成分具有较高的开发价值。

综上所述，本研究中尚未发现柔弱斑种草PB对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌金黄亚种、肠沙门氏菌肠亚种、铜绿假单胞菌的抗菌作用，但对A549细胞和SMMC-7721细胞增殖有一定的抑制作用，而PB抗肺癌的新药效尚无研究报道。