草莓多酚提取工艺优化及抗氧化性分析

华 玮, 熊丽娜 , 张永鑫, 孙 鹏, 岳 龙*, 付鸿博*

(1.红河学院·生物科学与农学学院·云南省高校滇南特色生物资源研究与利用重点实验室,云南 蒙自 661199;2.白城市林业科学研究院,吉林 白城 137000;3.汕头市林业科学研究所,广东 汕头 515000)

近年来,随着人们生活质量的提高,人们的消费观念逐渐开始向追求更高的生活质量转变,水果在人们的眼里有着越来越重要的价值,果树的生产也慢慢由追求产量转向了追求质量,果实品质在逐渐受到人们重视的同时[1],其富含的对人体有益的功能性物质也逐渐受关注,因此食用水果也在从口腹之欲逐步扩展到向吃的更健康转变,果实具有的营养价值、抗氧化能力等都开始走进了人们的视野[2]。多酚类化合物是广泛存在于植物体内的重要的次生代谢产物[3]。目前自然界已知晓的酚类化合物超过8 000种[4]。多酚在降低血糖、血脂、保护肠道、抑制细菌有着其独特的作用。同时多酚类化合物在医药、食品、运输保鲜、化妆品等应用及其相关领域的运用发挥着巨大的作用[5]。

草莓是蔷薇科草莓属的多年生草本植物,果实色泽鲜艳,有着独特的果实香味[6]。草莓果实富含多酚等生物活性物质,其含量多少与抗氧化能力密切相关[7]。不同品种的草莓在多酚含量上也有着显著的差异[8]。本研究对草莓多酚提取工艺、多酚含量及抗氧化性进行了研究,对丰富草莓果实多酚的研究内容、草莓功能性品种的选育、产品的研发和产业化发展提供了参考依据。

1 材料与方法

1.1 单因素对草莓多酚含量的影响

以红颜草莓成熟期果实为试验材料,用液氮将果实研磨成粉末,用0.1%酸化甲醇作提取液,利用超声辅助法进行提取。对甲醇体积分数、料液比、超声时间和提取次数4个因素进行单因素试验且每个因素均设置5个水平,甲醇体积分数分别为30%、40%*、50%、60%和70%;超声时间分别为10、15、20*、25、30 min;料液比分别为1∶8、1∶9、1∶10*、1∶11、1∶12(g∶mL);提取次数分别为1次、2次*、3次、4次和5次。当其中一个因素为变量时,*标记的因素保持恒定水平试验。

1.2 最佳工艺参数的确定

以1.1单因素对草莓多酚含量的影响结果为基础,设计四因素三水平正交组合(见表1)[9],对提取方法进行进一步优化,从而确定最佳的工艺参数[10]。

表1 正交试验组合表

1.3 多酚含量的测定

采用福林酚比色法[11]进行测定,以标准品没食子酸做标准曲线。具体试验操作如下:先吸取一定体积的提取液于试管中,添加福林酚试剂0.2 mL,混匀后静置4 min,再加入10% Na2CO3溶液1 mL,最后用ddH2O定容至8 mL,将定容后的混合物置于35 ℃下水浴1 h,在760 nm的波长下对其进行吸光值的测定。

1.4 抗氧化能力的测定

以清除DPPH自由基能力,亚铁还原能力和清除ABTS自由基能力3个指标评价草莓果实抗氧化能力[11]。

DPPH法测定抗氧化能力[12]。样品组:吸取0.2 mL样品稀释液,加入0.1 mmol/L的DPPH溶液2.8 mL,室温避光反应30 min;空白组:用40%甲醇替代样品稀释液。于517 nm 波长下测定吸光值,蒸馏水调零。

FRAP法测定抗氧化能力[13]。样品组:吸取0.1 mL样品稀释液,加入4.9 mL FRAP溶液[0.1 mol/L醋酸钠缓冲液(pH=3.6)∶10 mmol/L TPTZ:20 mmol/L三氯化铁=10∶1∶1(V/V/V)] ,室温避光反应10 min;空白组:用40%甲醇替代样品稀释液。于593 nm 波长下测定吸光值。

ABTS法测定抗氧化能力[14]。样品组:吸取0.1 mL样品稀释液,加入3.9 mL ABTS+溶液(7 mmol/L的ABTS储备液和140 mmol/L的过硫酸钾溶液在室温下暗反应12～16 h配制而成),室温避光反应10 min;空白组:用40%甲醇替代样品稀释液。于734 nm 波长下测定吸光值,蒸馏水调零。

1.5 数据分析

采用 Microsoft Excel 2007、SPSS 25、SAS 9.2、OriginPro 9.0软件进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 草莓多酚提取单因素试验

随甲醇体积分数的增大多酚含量表现为先升高后降低。甲醇体积分数为60%对应的多酚含量达到大值(见图1)。当甲醇体积分数为30%、50%、70%时,草莓提取的多酚含量显著(P<0.05)低于甲醇体积分数为60%时草莓提取的多酚含量。由图2可知,随着料液比的增大,草莓多酚含量呈现先上升后降低的趋势。当料液比为1∶9时对应的草莓达到最大值,当料液比为1∶8、1∶11、1∶12时,草莓提取的多酚含量显著(P<0.05)低于料液比为1∶9时对应的草莓多酚含量。再继续增加料液比会导致其他杂质增多,而导致提取草莓多酚的含量下降。由图3可知,随着超声时间的延长,草莓提取的多酚含量呈现先上升后降低的趋势。当超声时间为20 min时,对应的草莓提取的多酚含量达到最大值。超声时间的长短对草莓提取的多酚含量的影响无显著性差异。由图4可知,随着提取次数的增大,草莓提取的多酚含量呈现先上升后降低的趋势。当提取次数为2次时,对应的多酚含量达到最大值,当提取次数为1、4、5次时,草莓提取的多酚含量显著低于提取次数为2、3次的草莓果实提取的多酚含量。

图1 不同浓度甲醇对草莓多酚含量的影响

图2 料液比对草莓多酚含量的影响

图3 超声提取时间对草莓多酚含量的影响

图4 超声次数对草莓多酚含量的影响

2.2 草莓果实多酚提取条件优化

根据单因素试验结果,采取4因素3水平正交试验L9(34)对草莓多酚提取工艺进行优化。通过正交试验结果(见表2)可以发现RD>RA>RB>RC,故影响草莓果实多酚含量的因素从高到低依次是提取次数>甲醇体积分数>料液比>超声时间,同时可以看出其最佳提取工艺条件为A3B2C2D3,即甲醇体积分数为60%,料液比为1∶9,超声时间为15 min,提取次数为3次,由于A3B2C2D3在正交试验中没有出现,故根据此提取方法进行进一步试验,在该提取条件下测得的草莓果实多酚含量为2.01 mg/g,高于以上9组试验。因此确定最优的提取条件为甲醇体积分数为60%,料液比为1∶9,超声时间为15 min,提取次数为3次。将正交数据进行方差分析后发现(见表3):因素C(超声时间)对多酚提取量的影响呈显著水平(P<0.05),因素A(甲醇体积分数)、B(料液比)和D(提取次数)对多酚提取量的影响呈极显著水平(P<0.01)。

表2 草莓多酚提取工艺正交结果分析

表3 正交结果方差分析

2.3 红颜草莓果实多酚及抗氧化性的动态变化

根据正交试验得出的最佳工艺参数,对红颜草莓果实不同发育时期的多酚含量进行测定(见图5)。结果表明:多酚含量在草莓果实发育的3个时期均存在显著性差异(P<0.05),且随果实发育表现为先降低再升高的趋势,多酚含量在转色期最低,在成熟期最高。为了探究草莓的抗氧化能力,对红颜草莓果实发育的3个时期的抗氧化性进行测定(见图6)。结果表明:在红颜草莓果实的白熟期、转色期、成熟期3个时期中,从白熟期到转色期的清除DPPH自由基能力、亚铁还原能力和清除ABTS自由基能力均表现为降低的趋势,到成熟期又表现为升高的趋势,并且达到3个时期中的最大值。同时可以发现,在果实发育的同一时期,抗氧化指标之间也存在着差异,表现为清除ABTS自由基能力最强,其次为亚铁还原能力,最低为清除DPPH自由基能力。

图5 红颜草莓果实多酚含量动态变化

图6 红颜草莓果实抗氧化能力分析

2.4 不同品种草莓果实多酚含量的分析

根据正交试验得出的最佳工艺参数,对5个草莓品种进行了果实多酚含量的测定(见图7)。多酚含量在不同草莓品种间存在差异,雪里香草莓的多酚含量(2.52 mg/g)在5个品种中含量最高,且与其余4个品种均呈显著性差异(P<0.05),其次为雪兔、红颜和隋珠3个品种,多酚含量最低的为章姬草莓(1.58 mg/g),且显著(P<0.05)低于其他品种。

图7 不同品种草莓果实多酚含量

3 讨论

多酚类化合物广泛的存在于植物体内,原材料丰富,导致提取的方法也多种多样,现有的多酚提取方法有:溶剂萃取法[15]、超声波辅助提取法[16]、生物酶解提取法[17]、超临界CO2萃取法[18]、膜技术提取法[19]和超高压提取法[20]等。这些研究方法为多酚从原材料中提取提供了非常重要的科学依据。一般认为超过20 kHz的机械波被称为超声波,而超声波辅助提取于其他提取方法相比具有明显的优点,提取率更高且消耗更少[21]。研究者目前也多采用超声辅助提取法对活性物质进行提取,4个因素对薜荔果多酚提取量影响最大的是提取时间,最小的是料液比[22]。在香菇的多酚提取研究中发现,最小的影响因素同样为乙醇浓度,但最大的影响因素为提取温度[23]。对黑老虎果皮多酚提取工艺研究中发现,各个因素对多酚得率的影响由高到低分别为:料液比、超声时间、超声功率、乙醇体积分数[24]。在红枣的研究中,各因素对多酚得率的影响主次因素分别为:超声温度、料液比、甲醇浓度、超声时间[25]。通过前人的研究中可以发现,各因素对多酚含量的影响在不同物种间差异较大,因此在提取时不能照搬其他物种的提取条件,需要分析后在本物种中进一步进行试验。本研究利用红颜草莓为试验材料,以超声波辅助提取法(40 kHz)对多酚含量进行提取,以酸化甲醇为提取液,分析4个因素,包括甲醇体积分数、料液比、超声时间和提取次数对草莓多酚含量影响进行分析后,得出多酚提取量受提取因素的影响最大的是提取次数,其次是甲醇体积分数,再次是料液比,最小的是超声时间。同时确定了最佳提取工艺条件为甲醇体积分数60%,料液比1∶9,超声时间15 min,提取次数3次,该条件下多酚提取量为2.01 mg/g。多酚类物质种类丰富,在植物体中有几千种,同时不同植物中多酚物质种类、数量和含量都有较大的区别,因此导致了对多酚提取工艺进行研究时在不同物种中存在较大差异。

根据确定的最优提取条件,对红颜草莓果实的3个发育时期(白熟期、转色期和成熟期)多酚含量进行测定后发现,红颜草莓果实的多酚含量从白熟期到转色期呈现为降低趋势,到成熟期又表现为升高的趋势,且在成熟期含量最大。在其他果树研究中发现,苹果[26]、木枣[27]、石榴[28]果实发育中多酚含量呈现出先升高后降低的趋势,与草莓果实生长发育有较大的差异。其原因可能是草莓在转色期光合产物较少,影响了草莓多酚物质的积累,而在成熟期随着草莓果实转色的完成草莓果实的营养物质积累达到最大值,多酚含量也达到最大值。为了进一步研究不同品种草莓间多酚含量的差异,选择了5个品种的草莓对其果实多酚含量进行测定后发现,5个品种草莓之间的多酚含量存在着差异,其中雪里香草莓的多酚含量最高(2.52 mg/g),章姬草莓最低(1.58 mg/g)。在不同的研究中发现,草莓样品的提取方法对多酚含量的影响较大。王志巧[29]等人对草莓干样的多酚含量进行测定,得出最佳提取条件为提取溶剂50%乙醇,料液比1∶20,时间3 h,温度70 ℃,在此条件下草莓多酚类化合物含量最高为24.6 mg/g。程安玮[30]等人,对比了冷冻干燥、热风干燥、真空干燥方式及干燥温度对草莓多酚含量的影响,得出结论冷冻干燥方式可以较好的保持草莓果粉中的多酚。李芬芬[31]等用超声波辅助法提取草莓干样中的多酚含量,结果发现与常规方法相比,提取草莓中的多酚含量较高,为10.96 mg/g。超声波辅助法利用超声波产生的机械作用,能够加快体系的传速和传热速度,加强细胞内物质的释放,从而大大提高了植物中多酚含量的扩散和浸出,提高提取量。

通过分析草莓的抗氧化能力发现红颜草莓果实的抗氧化能力在果实成熟期最强,在果实转色期最低。同时发现草莓果实对清除ABTS自由基能力最强,其次为亚铁还原能力,最低为清除DPPH自由基能力。以不同成熟期的草莓果实为材料,以DPPH自由基清除能力和亚铁还原能力为抗氧化评价指标,随着果实的发育期草莓果实的抗氧化能力呈先下降后上升的趋势,且下降趋势比较明显[32]。王婉馨[33]等以4个红色草莓品种和2个白色草莓品种果实为材料,结果发现红颜草莓果实对清除ABTS自由基能力最高,妙香草莓的亚铁还原能力最高,这些均与本研究结果一致。在其他果树中也有同样的研究,以不同发育期的苹果果实为材料,发现抗氧化能力幼果期较高,随着发育呈减少趋势,同时发现苹果果实对清除ABTS自由基能力最强[34]。分析不同成熟期的红枣的抗氧化能力后发现,枣果实清除DPPH自由基能力随着果实的发育逐渐降低,最后趋于平稳,且未成熟的枣果实清除DPPH自由基能力最强[35]。这些结果与本研究结果存在一定的差异,这可能是由于多酚含量的差异所致。

4 结论

基于单因素和正交试验分析得出草莓果实多酚提取的最佳提取工艺为甲醇体积分数60%,料液比1∶9,超声时间15 min,提取次数3次,在最优的工艺参数下提取的多酚含量为2.01 mg/g。提取次数对多酚提取量影响最大。红颜草莓在果实发育不同时期的抗氧化能力表现为成熟期>白熟期>转色期。在最优提取工艺的处理下,雪里香草莓果实的多酚含量在5个草莓品种中多酚含量最高,章姬草莓果实的多酚含量最低,不同品种草莓多酚含量存在差异。