牦牛BMP7基因的克隆及其在发情期卵巢、子宫的表达分析

2023-11-28常攀峰潘阳阳张莉敏王斌峰董雨君

家畜生态学报 2023年11期

常攀峰,张辉,潘阳阳,张莉敏,王斌峰,董雨君

(1. 甘肃省畜牧兽医研究所,甘肃平凉 744000;2. 甘肃省动物疫病预防控制中心,甘肃兰州 730046;3. 甘肃农业大学动物医学院,甘肃兰州 730070;4. 甘肃省泾川县畜牧兽医中心,甘肃泾川 744300;5. 甘肃省庄浪县畜牧兽医中心,甘肃庄浪 744699)

骨形态发生蛋白(BMP)是转化生长因子β(TGF-β)亚家族成员中具有多功能的细胞因子[1]。BMP7作为BMP亚族的核心成分,广泛分布于动物机体的各个组织细胞中,参与多种生理病理代谢[2-4]。在雌性动物的生殖系统中,BMP7不仅维持着卵巢、输卵管、子宫等正常功能,对HPG轴(下丘脑-垂体-卵巢)也具有一定的调节作用[5-7]。在卵巢中,BMP7作为多功能细胞因子,旁分泌作用于膜细胞的同时控制着各类颗粒细胞的发育,即BMP7作用于PCNA和Caspase3等基因,进而调控颗粒细胞的增殖和凋亡[8-9];此外,BMP7还可作用于类固醇类激素的生成和分泌[8],刺激卵泡和黄体的生成。Bahire[10]发现,在生殖力相对较弱的个体和品种的卵巢中存在着大量的BMP7。另外,全基因组亚硫酸氢盐测序结果表明,卵巢中BMP7基因的DNA甲基化水平与羊的繁殖能力相关[11]。在猪中,BMP7是与排卵率和产仔数性状相关的潜在基因[12],据报道,BMP7基因启动子中的g.581771886变异与初胎窝仔数和总窝仔数有关[12],且其多态性影响着动物的生殖性状[11-12]。

牦牛生活在海拔3 000 m以上的青藏高原,因自身特点能在气候寒冷多变的恶劣环境中负重驰骋而被誉为“雪山之骄”。该物种是典型的季节性发情动物。就雌性牦牛来讲,一般2～2.5岁达到性成熟,夏季发情,发情周期约20 d,孕期约260 d,一年产一胎或两年一胎[13],繁殖力极低。与其他哺乳动物相似,牦牛发情也严格受神经内分泌的调节。研究表明,发情期牦牛的FSH、LH和E2等生殖激素血清浓度显著高于未发情牦牛,卵泡数量也更多[13-14]。Chen等[15]通过对发/乏情期和妊娠期牦牛的卵巢转录组和蛋白组学的对比测序发现,BMP15,BHLHE40和SF1IX1等基因[14]是调控牦牛发情的关键基因。牦牛卵母细胞的发育成熟与TGF-β1、BMP2等基因有关。此外,上述转化生长因子基因还广泛表达于牦牛的卵巢、子宫、输卵管等生殖器官[16-17]。然而,就目前研究报道,尚未有BMP7基因在牦牛卵巢、子宫上作用的研究报道。因此,本研究通过提取发情期牦牛卵巢、子宫组织中蛋白和RNA,对反转录得到cDNA作为模板进行克隆,并测序。运用NCBI等生物学网站对测序结果加以分析。通过qRT-PCR和Western Blot试验对BMP7的表达水平进行检测,探究其在卵巢、子宫中的调控机制,为进一步研究牦牛的生殖生理提供理论参考和数据支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

在青海省西宁市大通牦牛养殖基地,选取3头3～4岁处于发情期的健康母牦牛。宰后取其子宫、卵巢于生理盐水中漂洗3次,并去除其周围的结缔组织和脂肪,无菌手术剪分离后放置冻存管、液氮内保存。回实验室放置-80 ℃超低温冰箱保存。

1.2 试验方法

取出冻存的子宫、卵巢组织进行无菌研磨,同时加入液氮研磨成粉,分别放置两个离心管中,用于提取RNA和蛋白。

参照RNA提取试剂盒(ER501-01,全式金,北京)说明书,提取子宫和卵巢的RNA,测定RNA的浓度和OD值。参照反转录试剂盒(AH411-02,全式金,北京)将RNA反转录为cDNA,测定相应的OD值,并稀释浓度至300 mg/mL,冻存至-80 ℃冰箱内备用。

使用全蛋白提取试剂盒(BC3710,索莱宝,北京)提取子宫、卵巢的全蛋白;用BCA蛋白浓度测定试剂盒(PC0020,索莱宝,北京)测定蛋白浓度,冻存至-80 ℃冰箱内备用。

1.2.1 引物的设计与合成以牦牛BMP7基因(NCBI序列号NW_005392954.1)为参照,使用Primer Premier v5.0软件(Premier Biosoft, Palo Alto, CA, USA)设计引物,如表1所示;β-actin为内参。所用引物由西安擎科生物有限公司合成。

表1 BMP7基因克隆引物Table 1 The primer of BMP7 gene cloning

1.2.2BMP7基因的克隆以cDNA为模板,对BMP7基因PCR扩增。反应体系为20 μL:TaqPCR Master Mix 10 μL,ddH2O 7 μL,cDNA 1 μL,上下游引物各1 μL;扩增条件:预变性95 ℃,5 min;变性95 ℃,30 s;退火温度如表1所示;72 ℃延伸,10s;35个循环。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定。扩增的cDNA纯化后,送至上海生物工程有限公司测序。

1.2.3 牦牛BMP7基因生物信息学分析对牦牛BMP7测序结果进行生物学分析,具体分析网站和软件见表2所示。

表2 生信分析网站Table 2 The website of bio-information

1.2.4 qRT-PCR 荧光定量PCR均在LightCycler 96 R系统(罗氏,巴塞尔,瑞士)上进行。GAPDH基因(秦科,中国西安)序列见表1。qRT-PCR反应体系为25 μL,包含0.5 μL cDNA,1 μL上下游引物,12.5 μL SYBR premix EX TaqTM II (2×)(索莱宝,北京)和0.5 μL ROX Reference Dye II (50×)(索莱宝,北京)。qRT-PCR的反应条件,即:95 ℃30 s,95 ℃ 10 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 延伸10 s,冷却40 ℃ 10 s。

1.2.5 Western Blot 将上述2.2提取的全蛋白进行SDS-PAGE电泳分离;所需的目标片段转移至PVDF膜(YA1701,索莱宝,北京),脱脂牛奶(D8340,索莱宝,北京)37℃封闭2 h,一抗BMP7(1∶1000),β-actin(1∶2500,Abcam,USA)4 ℃孵育12 h,TBST洗涤1 h,二抗(兔抗鼠IgG,1∶5000,Abcam,USA)孵育2 h,洗涤1.5 h,ECL检测,Image J检测表达蛋白的灰度值;β-actin为内参,所有试验三次重复。

1.2.6 数据分析 Image J测定BMP7和β-actin的灰度值,计算二者比值。以GAPDH为内参,依据2-ΔΔCT法计算基因相对表达量。通过GraphPad Prism 7.0的t-test检验进行数据分析和作图。

2 结果与分析

2.1 牦牛BMP7基因的克隆

从图1可见,卵巢、子宫组织在428 bp和102 bp处均有特异性条带;通过Blast对比发现。与参考基因(NW_005392954.1)相似性可达100%,扩增基因可用于后续生物信息学分析和载体构建等。

图1 牦牛BMP基因克隆结果M. Marker;1.卵巢(PCR引物);2.子宫(PCR引物);3.卵巢(qRT-PCR引物);4.子宫(qRT-PCR引物)Fig. 1 The results of cloning BMP gene in yakM. Marker; 1. Ovary (PCR primer); 2.Uterus (PCR primer); 3. Ovary (qRT-PCR primer); 4. Uterus (qRT-PCR primer)

2.2 牦牛BMP7扩增基因生物信息学分析

2.2.1 牦牛BMP7蛋白理化性质分析本研究中扩增出的基因片段为428 bp,编码142个氨基酸(如图2所示),化学式: C718H1101N205O200S8,分子量:16061.37,原子总数:2232个,理论等电位点(pI): 6.70;其中,在142个氨基酸中:Leu (L) 所占比例最大,共计18个,占比12.7%;而没有Pyl (O)、Sec (U) 和Cys(C)三种氨基酸;带负电氨基酸(Asp+Glu)14个,带正电氨基酸(Arg+Lys)13个;消光系数(M-1cm-1,在水溶液中在280 nm处测量)为15 470。该蛋白不稳定性指数(II)计算为64.50,为不稳定蛋白。

图2 扩增牦牛BMP7基因和氨基酸序列Fig. 2 The amplification BMP7 gene of yak and translation of amino acid sequence

2.2.2 牦牛BMP7系统进化树构建对牦牛BMP7基因和其他物种(人、家鼠、马、猞猁、豹猫、野骆驼、羊驼、双峰驼、奶牛、水牛、野山羊、野猪和野犬)进行比对,结果如图3所示:与人的遗传距离为(Homosapiens,AAH08584.1)97.18%;家鼠(Musmusculus,ED106610.l)97.16%;马(Equuscaballus,ADK93983.1)95.07%;猞猁(Lynxcanadensis,XP 030165198.l)97.18%;豹猫(Prionailurusbenga,XP 043409554.1)96.48%;野骆驼(Camelusferus, XP 006186220.2)97.89%;羊驼(Vicugnapacos,XP 006214049.2)97.89%;双峰驼(Camlelusbactrianus,XP 010956884.1)97.89%;奶牛(Bostaurus,DAA23024.1)98.59%;水牛(Bubalusbubalis,XP 006049070.l 98.59%);野猪(Susscorfa,XP020932979.1)97.89%;野山羊(Caprahirus, XP 017913119.1)98.59%;野犬(Canislupusdingo,XP 030165198.l)97.18%。

图3 牦牛BMP7基因的系统进化树Fig. 3 Phylogenetic tree of BMP7 gene

2.2.3 牦牛BMP7蛋白二、三级结构预测通过phyre对预测的蛋白进行二级结构预测,如图4A所示:置信度线评估区域预测的可信度,红色表示高置信度,蓝色为低置信度;其中高度置信区间有9个;二级结构中,α螺旋最多,共62个,所占比例为54.67%;其次无规则卷曲40个,占比35.40%;TM螺旋11个,占比9.73%,而无β链的结构。为进一步确定其结构特点,利用Swissmodel对BMP7的三级结构进行预测,结果如图4B所示。

图4 牦牛BMP7基因的二、三级结构预测A.二级结构;B.三级结构Fig. 4 Prediction of the secondary and tertiary structure of BMP protein in yakA. Secondary structure; B.Tertiary structure

2.2.4 牦牛BMP7蛋白亲/疏水性及跨膜结构、信号肽预测分析通过protscale对牦牛BMP7扩增片段进行蛋白亲疏水性分析,以亲/疏水得分为纵坐标,编码的氨基酸位数为横坐标,结果如图5A所示,在142个氨基酸中,第19位氨基酸,亲水性值最大,为2.209;第53位氨基酸疏水性最大,为-3.215。牦牛BMP7蛋白跨膜结构预测分析,结果如图5B和5C所示:0～30位氨基酸为信号肽,在细胞内和细胞间进行信号传递;30～142位氨基酸均在细胞膜外;且0～28位氨基酸是由Sec转座转运,并由信号肽酶 I (Lep) 切割的“标准”分泌信号肽,切割位置是第29位氨基酸。

图5 牦牛BMP7蛋白亲/疏水性及跨膜结构、信号肽预测分析A. 亲疏水性;B.跨膜结构;C.信号肽预测Fig. 5 Prediction of BMP7 protein hydrophilicity, transmembrane structure and signal peptide in yakA.Hydrophilicity; B.Transmembrane; C.Signal peptide

2.2.5 牦牛BMP7蛋白磷酸化位点预测分析通过NetPhos对牦牛BMP7蛋白磷酸化位点进行预测,结果如图6所示。BMP7蛋白磷酸化位点共19个,其中Ser14个,Thr 2个,Tyr 3个。

图6 牦牛BMP7蛋白磷酸化位点预测Fig. 6 Prediction of BMP7 protein phosphorylation site in yak

2.3 发情期牦牛卵巢和子宫BMP7蛋白表达量

Western Blot如图7结果显示:BMP7蛋白在卵巢和子宫中均表达,且在卵巢中的表达水平显著高于子宫(P<0.05)。

图7 发情期牦牛卵巢和子宫BMP7蛋白表达量检测A. western blot检测;B. BMP7相对表达量Fig. 7 Expression of BMP7 protein in ovary and uterus of yak during estrusA. Western Blot; B.Relative expression of BMP7 protein

2.4 发情期牦牛卵巢和子宫BMP7 mRNA含量

通过qRT-PCR检测发现BMP7 mRNA含量与其蛋白表达量趋势一致,即发情期卵巢中BMP7 mRNA显著高于子宫(P<0.05)(如图8所示)。

图8 BMP7 mRNA的相对表达量Fig. 8 The relative expression of BMP7 mRNA

3 讨论

本研究成功克隆了牦牛BMP7基因,其片段大小为428 bp,与参考基因(NW_005392954.1)相似性可达100%。在NW_005392954.1给出的BMP7基因中,CDS区仅有22～439,32911～33103,57015～57163,75269～75466,80804～80880,82732～82842,84561～847107段。其中22～439 bp所涉及基因片段最长。因此,本研究以此段基因为靶点进行扩增,通过翻译预测,得到了142个氨基酸序列。通过亲/疏水性、跨膜结构和信号肽分析可知0～30号氨基酸是该结构蛋白中的信号肽,且0～28位氨基酸是由Sec转座转运,并由信号肽酶 I (Lep) 切割的“标准”分泌信号肽,切割位点为第29～30位氨基酸。表明BMP7是标准的分泌蛋白,具有多细胞因子的作用[20]。与已知物种的BMP7对比发现,该基因具有较高的保守性,序列相似性均>95%,其中与反刍动物的同源性更高,说明该基因在动物体内具有相似的生理功能[21-22]。值得注意的是,相较于其他物种的氨基酸序列,牦牛BMP7第140位氨基酸均为缬氨酸(Val),而其他物种的是甘氨酸(Gly)。除此氨基酸外,其他序列与奶牛、水牛的相似性可达100%。

BMP7是BMP/SMAD信号通路的重要配体[9,11],是影响动物繁殖能力的潜在因素。本研究通过BMP7在发情期牦牛的卵巢和子宫的高表达发现该基因也影响着牦牛的繁殖性能。研究表明,BMP7不仅高度表达于卵巢内的各种细胞,如颗粒细胞(GCs)和卵泡膜细胞(TCs),还对生殖激素具有一定的作用。张文静等[24]发现,BMP7(-/-)可抑制牛卵巢TCs分泌睾酮等雄激素,而BMP7(+/+)则可使水牛卵巢GCs[9]释放E2等激素,抑制黄体细胞(CL)[23]释放孕酮(P4)。BMP7还可促进GCs存活和增殖[9,24]。Lee等[25]将BMP7注射至大鼠卵巢中发现各个时期的卵泡数量均有增加,而排卵率和血清P4浓度均有降低[25],说明BMP7可刺激卵泡的发育和成熟。此外,大量文献证明卵巢BMP7水平和BMP7多态性与家畜的生育能力有密切的关系[26-27]。在绵羊中,高繁殖力母羊[28]的卵泡中FecB-BMP7蛋白显著高于其他母羊;猪BMP7基因3'-UTR多态性直接影响了母猪的产仔性能[12]。本研究通过BMP7在发情期牦牛卵巢、子宫的mRNA和蛋白表达发现,BMP7在卵巢表达量显著高于子宫(P<0.05),与es-BMP7最高表达于中华绒螯蟹睾丸组织相似[29],这可能是由于BMPs在生殖干细胞(GSCs)更新和维持卵子发生中具有重要作用。卵巢作为雌性生殖系统的核心器官,BMP7不仅参与了成熟卵子形成,还对卵母细胞成功受精具有一定的调控作用[30]。此外,BMP7在水牛妊娠期,可通过旁分泌作用胎盘血管的生成,刺激胎盘雌激素的产生[30]。综上,推测BMP7对牦牛繁殖生理具有重要作用,可作为一个新的研究方向,探究其相关功能作用。