胶质纤维酸性蛋白抗体致病机制的研究进展*

杨婷婷 综述,吴 鹏 审校

(重庆医科大学附属儿童医院神经内科/国家儿童健康与疾病临床医学研究中心/儿童发育疾病研究教育部重点实验室/儿科学重庆市重点实验室,重庆 400014)

在儿童期脑炎是最常见的高致死率及致残率的疾病,按照基本病因脑炎分为感染性脑炎、免疫性脑炎两大类,后者占全部临床拟诊脑炎患者的20%左右。它是一组由某些自身抗体、活性细胞或者相关因子与中枢神经系统神经元、胶质细胞(如少突胶质细胞、星形胶质细胞等)相互作用而导致的疾病。

既往对于免疫性脑炎的研究多集中于神经元,近年提出了自身免疫性星形细胞病的概念,包括以水通道蛋白4(aquaporin-4,AQP4)抗体为典型特点的视神经脊髓炎谱性疾病(neuromyelitis optica spectrum disorders,NMOSD)和以胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)抗体为标记物的自身免疫性胶质纤维酸性蛋白星形细胞病(GFAP astrocytopathy,GFAP-A)。目前对于AQP4-IgG致病机制的研究证实它是以体液免疫为主,其靶抗原AQP4属于抗细胞表面抗原,主要存在于构成血脑屏障的星形胶质细胞足突[1-2]。2016年LENNON团队在神经免疫实验室标本中检出GFAP-IgG,阳性率接近Hu、Yo抗体检出率的1/3[3],三者均属于抗细胞内抗原抗体。目前多认为抗细胞内抗原抗体并不直接致病,以细胞毒性T细胞介导为主[4],常导致不可逆的神经元损伤和死亡。对于GFAP抗体在GFAP-A的作用,目前研究尚不明确,本文就GFAP抗体的研究作简要综述,以期进一步加深对GFAP-A发病机制的认识。

1 GFAP概述

GFAP作为一种主要表达于神经系统成熟星形胶质细胞骨架中的标志性中间丝蛋白,在正常生理条件下血浆中这种蛋白质的水平通常很低[5];当出现中枢神经系统损伤,GFAP可以从胶质细胞中溢出进入周围细胞间隙释放入外周血,引起外周血中GFAP水平明显升高。然而其释放到血液中的机制和途径仍不完全清楚。有证据表明,GFAP及其分解产物可以通过蛛网膜绒毛大量流入血液、沿着淋巴结系统向颈部淋巴结流动,或在中枢神经系统屏障(即血脑屏障和血-脑脊液屏障)处持续进行双向液体交换[6]。一项系统评价发现,血清中的GFAP水平可反映多发性硬化(MS)等疾病造成的神经细胞受损的范围和程度,脑组织损伤越重GFAP释放越多,血清中GFAP水平越高,预后越差[7]。因此,肯定了 GFAP作为神经功能障碍和/或疾病进展的生物标志物的作用。

GFAP的释放为抗体的形成提供了条件。自身抗体是针对自身成分的免疫球蛋白,往往与免疫隔离部位隐蔽抗原释放、正常组织发生免疫原性改变、机体外来物质抗原模拟、抗体生成相关B/T淋巴细胞功能异常等相关[8]。正常人体血液可以有低滴度的自身抗体但不会致病,但如果自身抗体的滴度超过某一水平,就可能造成相应的病理改变诱发疾病。

2 GFAP-A的病理改变

中枢神经系统自身免疫性疾病具有很大的临床异质性,它与许多遗传和环境风险因素有关,疾病的特征是出现由中枢神经系统细胞和免疫系统细胞形成的病理改变,T细胞和巨噬细胞是炎症的主要介质。这些细胞侵入中枢神经系统并通过不同的细胞机制调节神经胶质细胞和神经元的活性,导致患者脱髓鞘和细胞死亡。研究发现,由于Toll 样受体的表达星形胶质细胞可以充当免疫细胞在炎症过程中发挥作用,它可以改变血脑屏障的通透性使免疫细胞迁移到中枢神经系统,通过产生IL-12、IL-23 和 IL-27调节T细胞谱系的表达[9]。然而,星形胶质细胞是非传统的抗原递呈细胞,仅在中枢神经系统损伤时才发挥免疫功能。炎症情况下,MHC分子及共刺激分子的表达使星形胶质细胞成为专业的抗原递呈细胞。多发性硬化患者死后脑组织的活检已在星形胶质细胞中检测到 MHCⅠ和 MHCⅡ分子的表达,体外实验亦发现IFN-γ可诱导星形胶质细胞MHCⅠ分子过度表达[9]。

ROSTAMI等[10]对培养的人类细胞进行了广泛的研究,证实了星形胶质细胞的抗原递呈能力,MHC Ⅰ和 MHC Ⅱ对抗原的共定位表明星形胶质细胞能够交叉递呈抗原成分。抗原物质一旦被星形胶质细胞摄取,可以充当 MHC Ⅱ通路的抗原,也充当 MHC Ⅰ通路的抗原。同时,星形胶质细胞可将与 MHC Ⅱ结合的抗原转移到大脑中的其他星形胶质细胞,从而刺激更多的星形胶质细胞成为专业的抗原递呈细胞。外源性抗原通过 MHC Ⅱ通路激活CD4+T细胞,而内源性抗原(病变的自身细胞,如病毒感染细胞或癌变细胞等)通过 MHC Ⅰ通路激活细胞毒性 CD8+T 细胞。内源性抗原通过 MHC Ⅰ途径递呈,其中抗原在蛋白酶体降解途径中被片段化为 8～10 个氨基酸,在內质网中MHC Ⅰ和抗原结合,然后抗原-MHC Ⅰ复合物被转运到细胞表面与 CD8+T 细胞相互作用。

由于颅内活检取材困难,现对GFAP-A的病理分析多以动物为主。在小鼠模型中已经证明,GFAP特异性的CD8+T细胞可以自发地渗透到中枢神经系统的灰质和白质,导致复发-缓解性脑脊髓炎,表明GFAP星形细胞病变是由GFAP多肽特异性细胞毒性CD8+T细胞介导的[11]。广州研究所对8例GFAP-A患者的病理活检分析发现:GFAP-A患者颅内炎症部位,特别是血管周围均显示CD8+T细胞浸润为主,且CD8+T细胞多见于营养不良神经元和星形胶质细胞附近[12]。同时意大利队列里也发现患者脑膜以CD8+T细胞、CD138+浆细胞浸润为主[13]。这些病理研究结果发现GFAP-A均以CD8+T细胞明显增多为主要病理改变,而如前述CD8+T 细胞通过MHC Ⅰ途径激活,这验证了早期梅奥研究团队对这一疾病的猜测:由于某些环境因素调促使表面MHC Ⅰ分子中的胶质纤维酸性蛋白衍生多肽上调,呈递在星形胶质细胞表面,成为GFAP-A细胞毒性T细胞攻击的合理靶点[3]。另一组国内队列对比了GFAP4阳性的患者和GFAP-IgG阴性患者的脑活组织,发现GFAP抗体阳性患者血管周围B细胞(CD20)和T(CD3+)细胞明显,在间质和血管周围可见丰富的 CD138+浆细胞,免疫组织化学分析显示星形胶质细胞和神经元丢失,浆细胞在颅内的聚集也进一步支持颅内是GFAP抗体的产生部位[14]。

3 GFAP-IgG产生原因分析

3.1 肿瘤

14%～34%的GFAP-A患者患有肿瘤,且66%的患者在相关神经症状出现后2年内发现肿瘤,其中卵巢畸胎瘤多见[3,13]。因此有研究推测,GFAP-A自身免疫可能是一种由表达神经元或神经胶质细胞成分的肿瘤激活的副肿瘤性免疫反应[15-16]。随着相继出现的病例报道[17-18]表明了颞叶星形细胞瘤、胶质瘤、腹膜后副神经节瘤等神经系统肿瘤与GFAP-IgG抗体出现存在一定关系,进一步佐证了在肿瘤中表达的GFAP可能是一种触发副肿瘤性神经自身免疫的免疫抗原。

针对膜抗原(如膜受体、通道或分泌分子)的抗体在疾病发病机制中起直接致病作用,这一点在针对NMDAR 的抗体中得到了最清楚的证明。而抗Hu、Yo、Ma2抗体等副肿瘤抗体属于胞内抗原抗体,其靶抗原位于细胞质或细胞核内不易被抗体接触。因此目前普遍认为它们不会直接促进发病机制,而是通过针对细胞内的自身靶标形成免疫复合物、免疫激活和其他过程间接造成损害,尤其是CD8+T细胞介导的免疫反应。针对患者的病理研究发现,Hu抗体阳性的副肿瘤综合征患者,其脑和周围神经组织中有较多CD8+T淋巴细胞浸润,并与表达MHC Ⅰ类分子的神经元紧密接触[19];而在Yo抗体阳性的患者小脑中也有大量CD8+T细胞浸润,但无明显的IgG沉积或B细胞聚集[20]。可见,T细胞介导的免疫反应是针对细胞内抗原的抗体的重要损伤机制。与副肿瘤抗体相同,GFAP抗体亦属于胞内抗原抗体,因此有学者推测GFAP抗体是一种直接或间接参与GFAP-A发病机制的副肿瘤抗神经细胞抗体[21]。那么,对于表现为GFAP-IgG阳性的脑膜脑脊髓炎,起源于表达GFAP的肿瘤,包括肠胶质细胞、非髓鞘施万细胞、软骨细胞、成纤维细胞、肌上皮细胞和淋巴细胞相关肿瘤或许是筛查的重点。

3.2 重叠抗体

GFAP-A通常与其他与星形胶质细胞、神经元和少突胶质细胞结合的自身抗体共存,如N-甲基-D-天冬氨酸受体抗体(NMDAR-IgG)、水通道蛋白4抗体(AQP4-IgG)、髓鞘少突胶质细胞糖蛋白抗体(MOG-IgG)等[22]。国外有研究发现大约40%的GFAP-A患者有一种或多种共存抗体,其中NMDAR-IgG是最常见的共存抗体,AQP4-IgG是第二常见的[17]。国内研究发现33.3%的患者存在共存抗体,这表明共存抗体在中国GFAP星形细胞病变患者中也非常常见[14]。另有个案研究发现首诊为AQP4-IgG阳性NMOSD患者,在二次发作中出现了GFAP-IgG,并且表现出典型GFAP-A临床特征[23]。

AQP4与GFAP均表达于星形胶质细胞,前者表达于星形胶质细胞膜上,而GFAP属于胞内蛋白。在APQ4阳性的NMOSD患者,血清GFAP的浓度与NMOSD的疾病活动、发作严重程度密切正相关,并且可以用于监测NMOSD的治疗效[24]。NMOSD期间AQP4-IgG损伤星形胶质细胞造成的GFAP的暴露是否为GFAP-IgG产生的直接因素尚不明确,但细胞内蛋白的暴露为可能的抗体产生提供了最基本的条件-抗原表位。

对于NMDAR的研究集中于神经元,目前已有研究证实所有7个NMDAR亚基(NR1、NR2A、NR2B、NR2C、NR2D、NR3A 和 NR3B)亦均在星形胶质细胞中表达[25]。AQP4-IgG与AQP4的结合主要通过诱发补体依赖性细胞毒性作用与抗体依赖细胞介导的细胞毒性作用,从而破坏星形胶质细胞本身。然而在神经元的研究发现,NMDAR-IgG主要作用于GluN1亚单位引起NMDAR交联和内化,使得神经元突触表面NMDAR水平明显降低,单分子显微镜技术证明了NMDAR-EphB2相互作用的破坏导致了突触NMDAR定位的丧失,移除抗体后NMDAR水平可恢复正常[26]。可见NMDAR-IgG主要是破坏靶细胞的功能,但对靶细胞本身并未引起明显的永久性破坏,其在星形胶质细胞是否存在与神经元同样的损伤机制尚不完全明确[27],NMDAR-IgG是否可引起GFAP水平的升高也需进一步研究证实。部分学者把眼光投向细胞因子,在GFAP-A及MOG-IgG相关疾病中均有白细胞介素6等相关脑脊液细胞因子升高,这可能参与了他们的发病机制,而两种不同的病理机制中可能存在一共同途径,引发这些抗体的共同存在[28]。

3.3 感染

感染激活的免疫反应可能是GFAP星形细胞病变的潜在病理生理机制。梅奥诊所的一项研究显示,近40%的GFAP星形细胞病变患者有前驱感染症状,其中病毒是最为常见的病原。多项病例报道了GFAP抗体的产生与人副流感病毒、单纯疱疹病毒有潜在关系[29-31]。

病毒可以通过直接感染、颗粒释放、靶细胞死亡、免疫介质(IL-1,IL-6、TNF-α、IFN-γ)等途径活化星形胶质细胞,活化后的星形胶质细胞表达MHCI类分子发挥抗原递呈细胞功能并分泌CXCL10,而CD8+T细胞表面有CXCL10的受体CXCR3,从而趋化CD8+T细胞造成星形胶质细胞的损伤。同时,活化后星形胶质细胞可以通过增加特殊蛋白质的表达来应对中枢神经系统病毒感染,其中最显著的是GFAP,这进一步增加了病毒感染的情况下组织破坏和细胞凋亡后释放抗原性GFAP的可能。我国学者在儿童结核性脑膜炎中发现患儿血清及脑脊液GFAP水平明显增高,经治疗后血清GFAP水平快速降至正常,脑脊液GFAP水平也随之缓慢下降[32]。另有报道布鲁氏菌感染后患者出现GFAP-IgG抗体阳性[33],发现受感染星形胶质细胞和小胶质细胞可诱导IL-6、IL-1b和TNF-α等炎症因子的分泌,导致星形胶质细胞凋亡、血脑屏障的完整性破坏,增加了细胞质内容物被免疫系统错误识别的机会[34-35]。

3.4 自身免疫性疾病

美国和意大利GFAP-A队列中有21%～27%患者有一种或多种共存的自身免疫性疾病,包括1型糖尿病、类风湿性关节炎、重症肌无力、溃疡性结肠炎、甲状腺功能减退症、银屑病关节炎等[13,17]。最近在类风湿关节炎患者的滑液中发现了GFAP自身抗体[36],这可能支持了GFAP自身免疫在类风湿脑膜炎中可能起作用的假设。表达GFAP的类星形胶质细胞(如间充质星状细胞)在多系统的广泛分布为中枢神经系统以外抗原性GFAP的提供了可能的解剖基础[37];而作为器官特异性或系统性自身免疫性疾病起病的诱发因素或其所诱发的机体内部免疫功能紊乱(如免疫失耐受导致自身反应性T、B淋巴细胞无法清除)亦可能通过血脑屏障或血脑脊液屏障累及中枢神经系统的星形胶质细胞。据报道在系统性红斑狼疮患者的 CSF中GFAP水平明显上调,神经精神性狼疮患者的血及脑脊液可以检测到GFAP-IgG,脑脊液中抗体水平升高尤为明显且随激素治疗后明显降低[38]。

此外,自身免疫性疾病治疗药物也会继发GFAP-IgG的表达。国外报道1例63岁的类风湿性关节炎患者接受依那西普治疗后出现激素反应性亚急性脑病和足下垂,经TBA/CBA法检测脑脊液抗体证实存在 GFAP 抗体,该患者接受激素和环磷酰胺治疗后症状消退[39]。2016年FDA批准的复发缓解型多发性硬化治疗药物Daclizumab也被发现在患者脑脊液引起GFAP-IgG表达[40]。然而,自身免疫性疾病及免疫检查点抑制类药物触发GFAP-IgG 的产生机制尚不清楚,需要进一步的临床与基础研究。

4 GFAP-IgG致病性的讨论

目前对于GFAP-IgG在疾病中的作用尚存在明显的争议,它作为标记性抗体还是致病性抗体并不明确。作为星形胶质细胞骨架中间丝蛋白的GFAP属于细胞内抗原成分,通常认为无法被自身抗体结合。任何病理因素导致星形胶质细胞的损伤都可能导致GFAP的释放,后经体液免疫诱导GFAP-IgG的产生,检出抗体可能仅仅是细胞免疫反应激活体液免疫后的副产物,能够提示发生细胞免疫的紊乱,是自身免疫反应导致的星形胶质细胞破坏的标志物,但抗体自身可能并不是介导致病作用的主要因素。目前的动物模型及患者标本的病理分析也多发现病变组织多以CD8+T细胞浸润为主,这也进一步证实了该推测,但病变组织处CD8+T细胞针对的为何种抗原目前尚需进一步明确。同时,研究者将其他细胞内抗原相关抗体注射到小鼠体内并没有人类疾病中所见的神经学发现或广泛的神经元破坏,而且抗体的沉积往往不在脑损伤最严重的地方,这进一步强化了人们对于细胞免疫在细胞内抗原相关疾病的发病机制中起着主导作用的认识,但其实使用 T 淋巴细胞诱导神经系统疾病的研究也没有成功[41-42]。

临床研究发现,以NMDAR-IgG为代表的细胞表面抗原抗体相关的疾病通常与非致死性神经元功能障碍相关,并且通常是可以治疗的;相比之下,与细胞内神经元蛋白抗体相关的疾病以非可逆性细胞死亡为特征,往往对治疗反应不佳。对于GFAP-A的临床随访发现,患者对激素治疗反应效果良好,这进一步提示仅以CD8+T细胞损伤解释该病的起病机制并不具有全面性。

同为细胞内抗原的Hu蛋白,目前一致认为其可激活T细胞,患者自身的T细胞在疾病过程中发挥着重要作用,抗体仅是疾病的一种结果而非原因。但有部分研究也得出了不同的结论,发现体液因素可能在其发病过程中起着同样重要的作用。较早的研究表明Hu-IgG直接导致了疾病的发生,并在尸检时发现患者脑组织中有抗体沉积;大鼠脑片培养时可见海马及小脑神经元快速摄取Hu-IgG导致神经元的死亡,部分Yo-IgG 相关副肿瘤性小脑变性患者的大脑中并没有淋巴细胞浸润,GFAP-A患者活体组织标本染色可见CD20+B细胞浸润并散在CD138+浆细胞和CD68+巨噬细胞,这证实体液免疫中在细胞内抗原抗体致病性方面起到了重要作用[43]。

目前部分学者提出了针对神经元细胞内抗原抗体直接致病机制的假设:抗体可能通过Fc段附着在神经元膜上并被内化,内化的抗体与其胞内靶抗原结合导致神经元损伤或死亡,受伤的神经元会上调 MHC Ⅰ,从而允许CD8+T细胞进行识别进而导致细胞死亡[44],这也可以部分解释体液免疫介导的损伤存在T细胞浸润的病理现象。同时有研究发现细胞内抗原成分可能短暂而出现于细胞膜,从而与抗体直接结合或由MHC Ⅰ呈递给CD8+T细胞直接引起相应的病理损伤。星形胶质细胞也被证实在损伤同时表达MHC Ⅰ的现象,其是否存在上述类似的体液免疫损伤机制尚需进一步体外及体内研究证实[43]。

综上所述,星形胶质细胞分布的广泛性为患者临床症状的多样性提供了解剖学基础,但GFAP-A起病机制方面的基础与临床研究难以得出相互完全支持的证据,甚至出现理论上相互矛盾的研究结果。这提示了GFAP-IgG致病机制的复杂性,它可能作为引发神经病理的原发致病事件发生,也可能作为继发性反应发生。一些细胞内抗原抗体在疾病发病机制中的作用已得到广泛研究,这些研究发现是否可以扩展到GFAP-IgG尚不明确,尝试通过抗体被动转移、抗原重组或T细胞被动转移等研究方法建立与人类疾病自然病程平行的动物模型或许可以解释GFAP-IgG的致病机制。