烟草青枯病的生物防治室内对峙试验

陆铮铮

（遵义师范学院，贵州 遵义 563002）

烟草青枯病是烟草上的三大病害之一［1］，是由青枯雷尔氏菌（RalstoniasolanacearumE.F.Smith）引起的一种土传病害，该病害在贵州广泛发生和流行，且常与其他根茎部病害（如黑胫病等）混合发生，造成75% 甚至更高的发病率，导致烟叶减产50%～60%［2］，严重影响烟草种植业的发展。烤烟已成为贵州遵义地区农民脱贫致富、乡村振兴的重要产业。烟草青枯病的发病率较高，目前对烟草青枯病的防治以化学防治为主，但化学农药阻碍了烟叶品质的提升。烟草青枯病的绿色生物防治方法对于改善烟叶的品质有较高的研究价值，因此，采用平板对峙试验筛选根围土壤中的拮抗放线菌、常用的中药和植物源水粗提液，为烟草青枯病的绿色防治提供重要依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株 采集遵义市务川县茅天镇红星村烟草种植区中烟草青枯病植株，带回实验室采用平板划线分离法分离、纯化。采用柯赫氏法则获得烟草青枯病病原菌后，用斜面保存方法进行保存备用。

1.1.2 供试根围土壤 遵义市务川县茅天镇红星村烟草种植区中有青枯病发病烟田中健康烟株的根围土壤。

1.1.3 供试中药 供试中药共32 种，购于遵义市中医院和洪永药店，中药的名称和供试浓度详见表1。

表1 供试中药名称及供试浓度 g/mL

1.1.4 供试植物源 供试植物源共27 种，市购，植物源的名称和供试浓度详见表2。

表2 供试植物源名称及供试浓度 g/mL

1.1.5 试验过程中使用的培养基

1）病原菌分离。牛肉膏蛋白胨琼脂培养基（NA）：牛肉膏3～5 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、琼脂20～25 g、蒸馏水1 000 mL。

2）土壤放线菌的分离。高氏合成1号培养基：可溶性淀粉20 g、NaCl 0.5 g、KNO31 g、K2HPO4·3H2O 0.5 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、FeSO4·7H2O 0.01 g、琼脂 15～25 g、水1 000 mL。

3）放线菌纯化。燕麦粉琼脂培养基：燕麦片30 g、琼脂17～20 g、水1 000 mL。

4）对峙试验。牛肉膏蛋白胨琼脂培养基（NA）和马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）：马铃薯（去皮）200 g、葡萄糖20 g、琼脂20 g、水1 000 mL［3］。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分离 平板划线分离法［3］：取一小块病组织，经75%酒精溶液和0.1%升汞溶液表面消毒后，用无菌水清洗3 次，置于无菌水中，用灭菌解剖刀将组织切碎。静置1 min 后，用灭菌的接种环蘸取上组织液在NA 平板上划线分离。置于32 ℃恒温培养箱培养3 d后，挑取单个菌落进行纯化培养。

1.2.2 土壤采集和放线菌分离 在有青枯病的烟田，选健康烟株的根围土壤，除去地面的落叶和垃圾，拨开表土约深5 cm，每土样约30 g，装入自封袋并做上记号，带回实验室。

采用稀释平板法分离土壤中放线菌［3］：土壤放于干燥无菌的地方下晾7 d 后，称取土样10 g，放入装有90 mL 无菌水和玻璃珠的三角瓶中，置于摇床震荡20 min，静置20～30 s，即成10-1土样稀释液。吸取10-1土样稀释液1 mL，移入装有9 mL无菌水的试管中，混匀、稀释，即成10-2稀释液。依此类推，制备稀释倍数为10-2、10-3、10-4。分别取不同浓度的稀释液0.1 mL 分散的放置于对应浓度标记的高氏合成1号培养基中，用玻璃涂棒在培养基表面轻轻地涂布均匀。放置20 min 后，倒置于28 ℃培养箱培养7 d。待放线菌的菌落形成后用灭菌的牙签小心的挑取菌体转移至燕麦培养基上进行纯化、备用。

1.2.3 中药液的配置 将中药粉碎成粉末状，称取粉末至于三角瓶中制备成所需浓度的中药液体，放置于灭菌锅灭菌即可。

1.2.4 植物水粗提液的制备 将新鲜样品用去离子水冲洗净并沥干表面水分、切碎。称取相应的样品放入灭菌的研钵中，加入相应的无菌水制备成所需的浓度，然后研磨成浆。2层纱布过滤，将得到的滤液5 000 r/min 离心5 min，取上清液。用0.22 μm 孔径枕针头式细菌过滤器进行过滤、除菌，即为植物水粗提液［4］。

1.2.5 拮抗放线菌、中药和植物源的筛选

1）拮抗放线菌的筛选。用灭菌的牙签挑取待测放线菌菌体接种在PDA 平板中央，置于28 ℃恒温培养箱培养，7 d后用无菌的喷壶将浓度为3×108cfu/mL 的烟草青枯菌悬液喷入接有待测菌的PDA 上，静置20 min，将平板倒扣置于30 ℃恒温培养箱培养，24 h 后观察并测量抑菌圈的直径。以PDA 平板上不接任何菌只喷有青枯菌的平板为对照，每种待测放线菌3个重复。

2）中药和植物源的筛选。将青枯病菌均匀的在NA 培养基上进行划线，然后将直径为5 mm 的无菌中性滤纸碟浸泡在中药液或者植物水粗提液中15 s，用镊子取出滤纸碟，将剩余的药液沥干，然后将吸附了药液的3张滤纸碟重叠放入上述NA 培养基中央，轻按压使其服帖，每种药液或者植物水粗提液3 个重复，以无菌水浸泡的滤纸碟为对照。做好标记，放入32 ℃的恒温培养箱中培养30 min 后将培养基倒扣继续培养24 h后观察、测量。

1.2.6 抑菌圈的测量 测量抑菌圈直径的大小（以mm为单位），计算其平均值。

抑菌圈直径=［（长直径-放线菌直径或者滤纸碟直径）+（短直径-放线菌直径或者滤纸碟直径）］/2

平均抑菌圈直径=重复的抑菌圈直径之和/3

2 结果与分析

2.1 不同拮抗放线菌对烟草青枯病的抑制效果

从6 份土壤中共分离62 株放线菌，通过平板对峙筛选出对烟草青枯病有抑制效果的拮抗放线菌有11 株。从表3 可知，平均抑菌圈直径最大的是放线菌F11（21.00 mm），11株拮抗放线菌的平均抑菌圈直径为12.40 mm。

表3 11株拮抗放线菌与烟草青枯病菌对峙的平均抑菌圈直径 mm

2.2 不同中药对烟草青枯病的抑制效果

32 种中药通过平板对峙筛选出对烟草青枯病有抑制效果的有27 种。从表4 可知，平均抑菌圈直径最大的是地榆（18.00 mm），27种中药的平均抑菌圈直径为9.40 mm。

表4 32种中药与烟草青枯病菌对峙的平均抑菌圈直径 mm

2.3 不同植物水粗提液对烟草青枯病的抑制效果

27 种植物水粗提液通过平板对峙筛选出对烟草青枯病有抑制效果的有17 种。从表5可知，平均抑菌圈直径最大的是大蒜头（27.60 mm），17种植物水粗提液平均抑菌圈直径为9.90 mm。

表5 27种植物水粗提液与烟草青枯病菌对峙的平均抑菌圈直径 mm

2.4 不同室内生物防治对烟草青枯病菌的对峙培养效果

由图1 可知，3 类室内生物防治的试验结果表明，大蒜头水粗提液抑菌圈直径（27.60 mm）＞放线菌F11 抑菌圈直径（21.00 mm）＞中药液地榆抑菌圈直径（18.00 mm）。平均抑菌效果来看，拮抗放线菌的平均抑菌圈直径（12.40 mm）＞植物水粗提液平均抑菌圈直径（9.90 mm）＞中药液平均抑菌圈直径（9.40 mm）。

图1 不同室内生物防治对烟草青枯病菌对峙培养的效果

3 小结

通过抗病品种的培育、休耕轮作、物理防治和化学防治等方法防治烟草青枯病，虽然有一定的防治效果，但各项方法都存在着一定的局限性。按可持续发展的要求，生物防治无疑是一种绿色、无公害的新型防治方式，越来越受烟农的青睐。其原因如下，一是利用从根围土壤中筛选的拮抗菌来防控病害，回接于原位生态环境中更易定殖，更易与病原菌竞争生态位点［5］，防治效果好，且绿色环保，对人畜安全。二是中药防治在病虫害的防治中是重要部分，随着科技的不断进步，我国对中药重视程度不断加深，可利用的中药种类越来越多，应用领域也越来越广泛，中药也成为植物病虫害防治试验研究中不可或缺的材料［6］。三是利用植物中的杀菌抑菌活性成分，结合现代植物有效活性成分提取技术，开发以植物为原料的生物农药具有效果好不易引起抗药性及不污染环境等优点［7］。试验选择3 种生物防治的方法，通过室内筛选发现，11株烟草根围土壤拮抗放线菌、27种中药和17种植物源水粗提液对防治烟草青枯病菌有效，其中，大蒜头水粗提液、放线菌F11 以及中药液地榆对烟草青枯病的防治效果较好，其平均抑菌圈直径分别为27.60 mm、21.00 mm、18.00 mm。

烟草青枯病生物防治方法是目前研究的热点［8］，在利用生物防治的同时也可结合田间管理、轮作或间作等进行综合防治。研究只探明了3类生物防治的室内防治效果，对其之间的复配以及田间的实际防治效果有待下一步研究。