灵芝高活力液体菌种培养条件的优化

和耀威,张 林,向 准,李 鹏

(1.贵州省生物研究所，贵州 贵阳 550009；2.贵州高山六芝园种植有限公司，贵州 贵阳 550014)

灵芝具有很高的药用价值，对提升免疫力、改善心血管系统和防治高血压等具有较好的作用[1]，市场前景广阔。传统的固体食用菌菌种生产相比液体菌种过程复杂，流程繁琐，生产周期长且成本高昂，菌种活力不均一，菌种上部易出现老化现象[2]，制约灵芝产业规模化集约化发展。液体菌种的生产是在发酵罐内进行，菌体细胞处于最适的温度、酸碱度、氧气、碳氮比等条件下，以动态方式培养，具有生产周期短、菌种纯度高活力强、接种方便、满袋（瓶）时间短、成品率高等优点，是食药用菌规模化和机械化生产的发展趋势。为缩短菌种生产周期和提高菌种活力，以液体菌种碳氮源筛选获得的结果为基础（一级液体种培养基配方为每升中含葡萄糖25.0 g，酵母浸粉5.0 g，CaCO30.2 g，KH2PO41.0 g，蛋白胨1.5 g，ZnSO4·7H2O 0.3 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，pH 自然），选用优化配方［二级液体种基质配方为每升中含葡萄糖2%，蔗糖2%，玉米粉1%，KH2PO40.1%，MgSO4·7H2O 0.05%，消泡剂（豆油）0.05%，pH 自然］作为发酵罐液体种的基础配方，通过测定不同对发酵液pH、培养温度、接种量、培养时间条件下的菌丝生物量，探究优化二级液体菌种的培养条件及生产工艺，以期为灵芝液体菌种的推广和应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验菌株选用南GL11，由国家菌草工程中心提供的福建省审定品种。

1.2 培养基配方

1.2.1 PDA 培养基 马铃薯20%、葡萄糖2%、琼脂2%，水1 000 mL。

1.2.2 摇瓶培养基配方(1 L) 葡萄糖25.0 g，酵母浸粉5.0 g，CaCO30.2 g，KH2PO41.0 g，蛋白 胨1.5 g，ZnSO4·7H2O 0.3 g，MgSO4·7H2O 0.5 g。

1.2.3 发酵罐液体菌种培养基 葡萄糖2%，蔗糖2%，玉米粉1%，KH2PO40.1%，MgSO4·7H2O 0.05%，豆 油0.05%，pH自然。

1.3 试验方法

1.3.1 摇瓶菌种和发酵罐培养基的制作

1）摇瓶菌种的制作。每个三角瓶装培养基500 mL，并加入少量玻璃珠，121 ℃高压灭菌30 min，冷却后在超净工作台中接种经过活化的母种菌块10 块。在培养箱内28 ℃黑暗静置2 d，肉眼可见菌块萌发后内置于摇床26 ℃培养4～5 d，转速为120～140 r/min。当摇瓶菌种培养好后，在超净工作台酒精灯火焰旁，按照无菌操作将液体菌种收集于已灭菌干燥的大三角瓶内，用于后续接种。

2）发酵罐培养基的制作。首先对空气过滤器进行单独灭菌，灭菌条件为121 ℃维持30 min，并调整空气阀大小，将空气过滤器吹干。然后进行发酵罐空消，将夹套中的水排干净后，进行121 ℃高温灭菌30 min。灭菌后待温度降至80 ℃以下，排干净管内冷凝水。最后将培养料投入发酵罐内，每个发酵罐装培养基40 L，高压灭菌30 min，冷却至25 ℃时接入摇瓶菌种1 500 mL，通入经过过滤的空气，培养5～7 d。

1.3.2 发酵罐菌种培养条件的优化

1）发酵液培养温度试验。试验温度24～32 ℃，共设置5 个温度处理，分别为24 ℃、26℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃。起始pH 6.0，发酵罐每罐装液量均为40 L，培养时间均为7 d。培养过程中观察并记录每个处理的菌丝体或菌丝球的生长情况，并统计每个处理的菌丝生物量。

2）发酵液起始pH 试验。以液体培养基为基础，试验pH 5～7，共设置5 个梯度处理，pH 分别为4、5、6、7、8。培养温度26 ℃，发酵罐每罐装液量均为40 L，培养时间均为7 d。观察并统计菌丝生物量。

3）发酵液接种量试验。选用容积为60 L的液体发酵罐，发酵罐每罐装液量均40 L；接种量1%～10%，共设置6 个处理，依次是接种量为1%、2%、4%、6%、8%、10%。培养基的起始pH 均调节至6.0，培养温度26 ℃，培养时间均为7 d。观察并统计菌丝生物量。

4）发酵液培养时间试验 发酵液培养时间范围4～8 d，共设置5 个时间处理，依次为培养4 d、5 d、6 d、7 d、8 d。发酵罐每罐装液量均40 L，培养基的起始pH均调节至6.0，培养温度26 ℃。观察并统计菌丝生物量。

1.3.3 菌丝生物量测定 各处理培养液混匀后取100 mL 发酵液，分装于两个50 mL 离心管内，置于离心机内，进行5 000 r/min 离心，时间为10 min。然后放入烘箱，50 ℃条件下烘干菌丝至恒重，测定各处理菌丝生物量干重。

1.4 数据统计与分析

所有试验数据均用SPSS Statistics 17进行统计分析（P＜0.05），用origin 进行绘图。

2 结果与分析

2.1 不同发酵液培养温度灵芝的菌丝生物量

从图1 可知，不同培养温度处理下，灵芝菌丝生物量具有显著性差异。其中培养温度为28 ℃时，菌丝生物量最重，达132.18 mg/100mL，培养温度为26 ℃时，菌丝生物量略有下降，为128.16 mg/100mL，但与28 ℃处理间无显著性差异。当培养温度较低，为24 ℃时，灵芝菌丝体生物量最少，为90.12 mg/100mL。温度从24～28 ℃变化时，菌丝生物量随温度的增加而增加；灵芝虽为高温菌，但当温度增加到32 ℃时，菌丝生物量降低，不适合菌丝体的生长与扩繁。因此灵芝发酵液的最适培养温度为26～28 ℃。

图1 不同发酵液培养温度灵芝的菌丝生物量

2.2 不同发酵液起始pH灵芝的菌丝生物量

从图2 可知，培养液pH 4～8 时，灵芝菌丝体均能生长，当发酵罐液体菌种的培养液起始pH 增加时，菌丝生物量出现先增后减的规律。pH 6 处理的菌丝生物量最大，为121.52 mg/100mL，并显著高于其余处理。菌丝生物量依次是pH 6 处理＞pH 5 处理＞pH 7处理＞pH 8＞处理＞pH 4处理。因此，灵芝最适pH为6，为偏酸性高温木腐菌。

图2 不同发酵液起始pH灵芝的菌丝生物量

2.3 不同发酵液接种量灵芝的菌丝生物量

从图3可知，不同接种量处理的菌丝生物量差异显著。其中接种量1%的生物量最低，菌种量过少，不利于短时间内获得足够菌丝量；接种量从1%增加到4%时，菌丝生物量从40.00 mg/100mL 急剧增加到132.00 mg/100mL。接种量增加到6%时，菌丝生物量比4%接种量相比略有降低，为128.43 mg/100mL，但两者间无显著差异；接种量达10%时，菌丝生物量下降至82.65 mg/100mL。接种量过低，萌发点少，菌丝生物量低；接种量过多，菌丝亦衰老自溶，菌丝生物量亦会降低。因此接种量以4%～6%为宜。

图3 不同发酵液接种量灵芝的菌丝生物量

2.4 不同发酵液培养时间灵芝的菌丝生物量

从图4 可知，4～6 d 处于对数生长期，菌丝生物量增加显著，6 d 时最高为123.60 mg/100mL，7 d 时菌丝生物量较6 d稍有下降，8 d 时菌丝生物量较6 d 显著降低，可能是由于6～7 d 时灵芝菌丝处于稳定生长期，菌丝生长量与消亡量处于动态平衡，生长状态基本趋于稳定。而从8 d 开始菌丝体进入衰亡期，菌丝量减少显著。因此，发酵罐液体菌种在的最佳培养时间为6 d，此时菌丝生物量最大，菌丝生命力旺盛，菌种活力强。

3 讨论与小结

不同液体菌种生产技术对灵芝生物量及相关代谢产物或营养成分的影响不同，有研究发现，接种量为10%、发酵周期6 d、pH 5.5时最适宜菌丝生物量和代谢产物的提升[3]；还有研究得出实现多糖高产的最佳发酵温度为27 ℃、培养基初始pH 6.0、发酵时间144 h[4]。本试验结果表明，培养温度为26～28 ℃时菌丝生物量最多，为128.16～132.18 mg/100mL，培养液pH 6 时菌丝生物量达最大值，为121.52 mg/100mL，灵芝的生物学特性表现为偏酸性高温菌。接种量过低，萌发点少，菌丝物量低；接种量过多，菌丝亦衰老自溶，菌丝生物量亦降低，接种量为4%～6%时菌丝生物量较高，为128.43～132.00 mg/100mL。发酵罐液体菌种的最佳培养时间为6 d，此时生物量最大，为123.60 mg/100mL，菌丝生命力旺盛，菌种活力强。因此，适宜发酵罐液体菌种的培养条件为培养温度26～28 ℃、培养液pH 6、接种量4%～6%、培养时间6 d。