苯甲酸在全价饲料中的抑菌效果评价

■ 任蒙蒙 董 伟 湛梦颖 汪仕奎 邢丽维

（帝斯曼（中国）动物营养研发有限公司，河北霸州 065799）

在现代畜牧业中，抗生素因安全问题已经被限制作为饲料添加剂使用，抗生素替代物成为动物营养研究的重点。市场上具有抑菌效果的产品种类繁多，作用机理和化学特性各不相同，如何科学有效地评估相关产品的实际效果给行业带来困扰[1-2]。目前，评估体外抑菌方法主要扩散法（琼脂平板扩散法和E-test法）、梯度稀释法（微量、大量肉汤稀释和琼脂稀释）、时间杀伤试验、薄层色谱生物自显影法、生物发光和流式细胞荧光法等[3]。首先，这些方法中所涉及的培养基均为标准培养基，而抑菌产品在饲料中的实际效果会受到多种因素的影响，比如饲料成分、pH。因此，基于标准培养基的评估方法无法准确模拟实际生产效果。其次，这些经典方法也具有各自的局限性。比如扩散法的抑菌原理是渗透扩散产生浓度梯度，适用于易溶于水的抑菌物质的测定，对于水溶性低的植物精油，可用二甲基亚砜进行助溶[4-5]，然而以二甲基亚砜为溶剂时,还需要注意其本身的抗菌作用[6]，而且添加助溶剂与实际使用场景有一定差别。琼脂稀释法操作繁琐，不适合实验室的常规开展，只能作为回顾性监测[7]。再次，因成本限制一般企业不具有使用薄层色谱生物显影和流式细胞荧光法评估抑菌剂性能的能力。由此可见，基于自身饲料配方组成、抑菌剂的特性、设备情况和操作的便利性等因素综合考虑开发出的评估方法，才能满足大多数全价饲料企业的现实需求。

作为一种安全有效的抗生素类添加剂，苯甲酸在畜禽生产中得到广泛的应用[8]。然而，苯甲酸微溶于水，不能使用基于扩散的牛津杯法等来评估其抑菌特性。类似于苯甲酸，低溶解度抑菌物质还有很多，比如姜黄素、大蒜素、白藜芦醇等[9-11]。本试验以苯甲酸为主要研究对象，研究一种基于全价饲料、具有直观、高灵敏、操作简洁的评估方法，以促进抑菌剂的科学合理使用，合理配置资源，降低饲料成本。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

氯化钠购于国药集团化学试剂有限公司；苯甲酸（含量98%）购于Sigma；青霉素钠（160万单位）购于商丘市成达动物药品厂；胰蛋白大豆肉汤（TSB）培养基、溶菌肉汤（LB）琼脂培养基均购于北京陆桥技术股份有限公司；保育料、鸡全价料、乳猪教槽料均由帝斯曼（中国）动物营养研发有限公司生产（不含有抗生素和苯甲酸）；大肠杆菌K88+（CVCC198）购于中国兽医微生物菌种保藏管理中心。

ZQWY-200 卧式全温振荡培养箱（上海知楚仪器有限公司）；GI54DWS高压蒸汽灭菌锅[致微（厦门）仪器有限公司]、GHP-9160隔水式恒温培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）、BSC-1300 Ⅱ A2 生物安全柜（苏净安泰）、Mf3菌落统计/显微细胞仪（杭州迅数科技有限公司）、OLS200振荡水浴锅（格兰特）、MS3002S型电子天平[梅特勒托利多科技（中国）有限公司]、紫外可见分光光度计[尤尼柯（上海）仪器有限公司]。

1.2 制备饲料培养基

将饲料粉碎后，过0.25 mm筛，取10 g加入90 mL超纯水10倍稀释饲料，再添加不同类型抑菌剂（可耐高温），充分混匀，然后进行高压蒸汽灭菌（115 ℃、20 min），当添加不耐高温的抑菌剂时，如抗生素，要在饲料稀释液灭菌后冷却至50 ℃以下时再添加，制备饲料培养基。

1.3 菌液制备及接种

将大肠杆菌K88+单菌落用胰蛋白大豆肉汤（TSB）液体培养基37 ℃培养3 h左右，取2 mL 加到比色皿中测定 OD值，OD600为0.5～1.0时，取100 μL菌液加入到饲料培养基中，接种后，饲料培养基中大肠杆菌的含量约为105CFU/mL。

1.4 不同时间点取样及培养

如图1所示，分别于接种前、接种后0 h和16 h取样。取100 μL 饲料培养基，加入到900 μL 生理盐水中，混匀备用。每一个处理组，分别取10、20 μL 和30 μL 混悬液滴加到LB 琼脂培养基中。37℃恒温培养18～24 h，用菌落计数仪进行观察并拍照。根据LB培养基上液滴处菌落生长状况评估抑菌剂的抑菌效果，与不含抑菌剂的对照组相比，菌落数减少即有抑菌作用，菌落数越少抑菌作用越强。

图1 检测流程

1.5 不同类型饲料培养基组成

在保育料、鸡全价料、教槽料饲料稀释液中分别添加0、0.03%、0.30%的苯甲酸（具体组成见表1），接种大肠杆菌培养后，观察大肠杆菌在不同类型饲料培养基中的生长差别。

表1 不同饲料培养基组成

1.6 保育料中添加苯甲酸和青霉素钠的抑菌效果对比

在保育料培养基中添加不同浓度的苯甲酸或青霉素钠（具体组成见表2），接种大肠杆菌培养后，通过与无抑菌剂空白组对比，观察不同浓度的抑菌剂的抑菌效果。

表2 不同含量苯甲酸和青霉素钠在保育料中饲料培养基组成

2 结果与讨论

2.1 方法的优势

如图1 所示，本试验检测周期为3d，操作步骤简单，不需要大型仪器，成本较低。本方法将培养皿分为三个区域，每一个区域内为一个处理组，在每个区域内滴入含不同体积（10、20 μL 和30 μL） 稀释液，形成小、中和大三个圆点，如图2 所示，从而可以在同一培养皿上观察不同抑菌剂的生长情况。

使用菌落法考察不同苯甲酸抑菌能力的大小时，将培养好的抑菌后菌悬液进行不同浓度梯度的稀释，每一个稀释度需要多个独立的培养皿作为平行[12]。相比而言，本方法减少了稀释梯度，节省了培养皿的使用量，减少涂布和计数时间，本方法可批量操作。使用肉汤稀释法时，加入抑菌剂培养24 h后，观察试管或96孔板底部，浑浊带有沉淀说明有细菌生长，澄清透明说明相应药物浓度有抑菌作用[13-14]。陈聪[15]和张昊雪[4]分别通过指示剂刃天青和TTC(2,3,5-三苯基氯化四氮唑)颜色的变化来表示细菌的生长，但是均无法直接对比澄清透明或无颜色变化的管（孔）之间细菌含量差异。如图3所示，本方法中处理组B2、C2、E2和F2在接种后培养16 h均比初始接种时的菌落数减少，说明在此浓度下均有抑菌作用，同时可根据菌落数的多少对比不同抑菌剂在此浓度下的抑菌性能差异。

图3 保育料中添加苯甲酸和青霉素钠的抑菌效果

抑菌培养24 h 后，古丽巴哈尔·托乎提[16]用一次性无菌接种环从试管取出1 环液体划线平板，唐亮[17]分别取各孔培养物20 μL，点种于培养基上，徐欣欣[14]从无细菌沉淀产生的孔中吸取10 μL 内容物滴至培养基，以是否生长菌落来判定抗菌物质的最小杀菌浓度（MBC）。类似地，本方法分别于接种前、接种后0 h和接种后16 h，取稀释液10、20 μL和30 μL滴加到培养基上，不仅能根据无菌落生长判定杀菌浓度，同时可纵向对比同一抑菌剂随时间菌落数的变化，判定抑菌剂在此浓度下的抑菌性能，横向对比同一抑菌时间下不同抑菌剂的抑菌效果。

苯甲酸溶解度较低，使用扩散法测定，牛津杯内或滤纸上会以晶体的形式析出，不能准确评估其抑菌效果。本方法有效避免扩散法对难溶物质测定的局限性。此外，本方法直接观察菌落数量，从而克服了使用比浊法受颜色干扰的问题[18]，为姜黄素等抑菌效果评估提供了方法。

2.2 不同全价饲料对抑菌效果的影响

本试验利用饲料培养基更接近实际，更能体现抑菌剂在生产中的实际效果。本试验所用的全价料均未添加苯甲酸和任何抗生素。由于苯甲酸在饲料中的添加量为3～5 kg/t[19]，所使用的培养基中选择苯甲酸添加浓度为0.30%。

如图2 所示，分别以保育料、鸡全价料和教槽料为培养基，在接种前，保育料、鸡全价料和教槽料中均没有菌落形成，说明该培养基因灭菌处理后为无菌状态。接种后0 h，所有处理组饲料均有菌落形成，且溶液边缘处菌落形成圆环，处理组间无差异，说明接种量一致。接种后16 h，保育料组和鸡全价料组在相同处理条件下，培养皿上菌落数及生长形态大体一致，且A1、D1 组菌落数明显多于接种后0 h，说明大肠杆菌在饲料液体培养基中生长良好；在相同苯甲酸浓度下，而教槽料组的菌落数明显少于保育料组和鸡全价料组，说明教槽料中本身存在其他因素直接或者间接抑制了大肠杆菌的生长。

张博[20]表明酸化剂在家禽养殖中的应用效果受基础日粮类型和日粮组成的影响。本试验中不同类型全价饲料添加同一浓度的苯甲酸，菌落数有差异，苯甲酸添加量为0和0.03%时，教槽料组中菌落数少于保育料组和鸡全价料组，苯甲酸添加量为0.30%时，教槽料组和保育料组的菌落数少于鸡全价料组，说明不同类型全价料对抑菌剂的抑菌效果存在影响，可根据不同类型全价饲料合理选择抑菌剂的添加量以节省成本。

2.3 保育料中添加苯甲酸和青霉素钠的抑菌效果

由图3可知，以保育料为培养基时，接种前所有处理组均没有菌落形成。接种后0 h所有处理组均有菌落形成，且溶液边缘处菌落形成圆环，处理组间无差异。接种后16 h，苯甲酸组中，C2组菌落数（苯甲酸0.1%）少于B2组（苯甲酸0.08%），二者均少于A2组（对照）；青霉素组中，F2组（青霉素钠0.003%）菌落数少于E2组（青霉素钠0.003 5%），二者均少于A2组（对照），D2组（青霉素钠0.002 5%）菌落生长情况与A2 组（对照）一致。B2组（苯甲酸0.08%）与E2组（青霉素钠0.003%）菌落数相似、C2组（苯甲酸0.1%）与F2组（青霉素钠0.003 5%）菌落数相似，说明在苯甲酸和青霉素钠在保育料中抑菌效果：C2组=F2组＞B2组=E2组＞D2组。苯甲酸和青霉素钠浓度分别增加时，菌落数随之减少，当苯甲酸和青霉素钠浓度分别变化0.02%和0.000 5%时，抑菌16 h后菌落数有明显的差异，说明本方法较灵敏。

酸化剂作用并不是剂量依赖性[20]，所以选择酸化剂的最适添加量很关键。同时，在使用每种酸化剂之前，需要具体考虑其抑制作用及效果[21]。由于本方法抑菌剂添加量在相对窄的范围，也能评估其抑菌效果的差别，在实际应用中，可根据需要评估抑菌产品的最适添加量，以节约成本。如图3所示，当抑菌16 h时，试验组的菌落数少于对照组A2，即有抑菌效果，根据试验组菌落数的疏密即可对比抑菌剂的抑菌效果强弱。

3 结论

本研究利用全价料做细菌培养基、构建肉眼可见的微量接种矩阵，建立了一种简洁、快速、灵敏度高的体外评估方法，可评估不同类型抑菌剂在不同类型饲料中的最适添加量。运用此方法试验得出：同一浓度苯甲酸以教槽料为培养基时，对大肠杆菌K88+的抑菌效果优于保育料和鸡全价料；在保育料中添加0.08%苯甲酸，可明显观察到对大肠杆菌K88+有抑制作用。