3 种添加剂对黄颡鱼抗组胺效果的评价

■ 刘学伟 王秋杰 刘淑林 许国焕 邹记兴*

（1.华南农业大学海洋学院，广东广州 510642；2.广东省科学院微生物研究所，广东广州 510070）

黄颡鱼分类上属于鲶形目、鲿科、黄颡鱼属。它是我国江河湖泊中常见的底栖肉食性鱼类，其肉质鲜嫩、肌间刺少、有较高的经济价值，人工养殖已经相当普遍[1-2]。鱼粉是养殖黄颡鱼的主要原料之一，生物胺尤其组胺是鱼粉新鲜程度判定的重要指标，鱼粉内的生物胺种类主要为组胺、腐胺与尸胺。组胺[2-(4-咪唑基)-乙胺]是由组氨酸脱羧酶合成，在机体的发育过程中有着不可或缺的作用。不同动物机体对于组胺不同浓度有不同反应，饲料中组胺水平达到18.00 mg/kg 能提高黄颡鱼的生长性能，组胺水平超过103.50 mg/kg 时能造成黄颡鱼机体氧化应激，导致抗氧化能力下降与胃肠结构损伤[3]。雏鸡日粮中添加含有组胺4.00 g/kg 的鱼粉时，雏鸡的胃部发生结构损伤并且抑制雏鸡的生长[4]。同时，饲料内组胺含量约400.00 mg/kg 时会使鳗鲡摄食率下降、发生白便和养殖周期延长[5]。在饲粮中添加480 mg/kg 组胺时，降低了巴沙幼鱼（Pangasianodon hypophthalmus）生长性能与机体抗氧化能力[6]。饲料中添加外源组胺剂量为400 mg/kg 时，对黄颡鱼的生长性能无影响[7]，但会对黄颡鱼的肠道与肝脏造成负面影响。

益生菌是一种对宿主健康有益的微生物，在日常生活中的应用广泛。罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri）可以稳定定植于动物肠道，促进动物机体生长[8]，还能缓解因硫酸葡聚糖钠（DSS）造成的小鼠肠道炎症[9]。复合物（碧生素）的主要成分是黄酮、微量元素与氨基酸等物质。黄酮类物质具有杀菌作用[10]，大豆黄酮还可以提高鹌鹑的产蛋率与生长性能[11]，也促进肉鸡的生长性能[12]。肉桂醛精油具有广谱的抑菌作用[13]，还可以改善草鱼的肠道免疫功能[14]。上述3 种物质作为饲料添加剂在畜禽研究中应用广泛，但在黄颡鱼养殖中研究较少。本实验拟通过在黄颡鱼饲料中添加组胺，在含有组胺饲料中分别添加罗伊氏乳杆菌、复合物与肉桂醛精油，评价几种添加物质对饲喂组胺的黄颡鱼幼鱼的生长性能、血清生理生化指标及肝脏抗氧化指标的影响，为黄颡鱼养殖中饲料添加剂的合理利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验对象饲喂与管理

由广州增城养殖渔场提供健康黄颡鱼鱼苗1 000 尾，暂养2 周并使用对照组饲料进行驯食。正式实验前停食24 h，随机挑选规格一致的鱼苗[平均体重（1.93±0.05） g]，分为5 组，每组3 个重复，每个重复35 尾鱼。实验鱼饲养于陆基循环养殖系统，圆形养殖桶直径1.5 m、高1 m。实验期间水温保持在（28±2） ℃，溶氧＞6.0 mg/L，水体pH 为7.0～8.0，氨氮＜0.1 mg/L。实验期间每3 d 换水1/3 左右，日投饲量为总体重的5%，每日投喂2 次，投喂时间分别为08：00 和17：30，实验周期为10 周。养殖期间记录每天死亡的鱼苗数量与体重，每2 周进行一次称重并调整投喂量。

1.2 实验饲料

使用二倍稀释法测定肉桂醛精油与复合物抑制大肠杆菌生长的最小浓度。肉桂醛精油与复合物使用吐温80 与纯水进行超声溶解后，配置成不同浓度稀释液并保存于4 ℃冰箱备用。吐温80 与纯水混合溶液作为空白对照。具体操作：在超净工作台内，吸取100 μL 浓度为106～107CFU/mL 大肠杆菌菌液涂布，每个培养基内放置3 个牛津杯（直径8.00 mm）。将肉桂醛精油与复合物不同浓度稀释液吸取200 μL于牛津杯内，在37 ℃恒温培养箱中培养24 h 后观察抑菌圈大小。当肉桂醛精油浓度为0.125 μL/mL、复合物浓度为2.18 μg/mL 时为抑制大肠杆菌生长的最小浓度。选取肉桂醛精油浓度为125.00 μL/kg 与复合物浓度为2.18 mg/kg 作为饲料中添加浓度。组胺购买自上海源纯生物科技中心；肉桂醛精油（99.8%）购买自阿拉丁试剂公司；罗伊氏乳杆菌、复合物（碧生素）由广州碧德生物公司提供；大肠杆菌为华南农业大学海洋学院保存种。

肉桂醛与β环糊精进行包埋技术处理[15]，将肉桂醛-β环糊精包合物喷洒在已烘干的饲料上；罗伊氏乳杆菌的菌液喷洒在已烘干的饲料，实验过程中测定罗伊氏乳杆菌的添加剂量为5.93×107CFU/kg；复合物为淡绿色的粉末，制作饲料中直接倒入饲料中。制作的饲料放入-20 ℃冰箱保存。本实验过程中使用的饲料原料为一般红鱼粉，而红鱼粉的生物胺含量相对白鱼粉较高[16]，实验过程中外源组胺添加剂量为400 mg/kg。实验分组为对照组（0 添加剂）、组胺组（组胺饲料组）、罗伊氏乳杆菌组（组胺+罗伊氏乳杆菌）、复合物组（组胺+复合物）、肉桂醛精油组（组胺+肉桂醛精油），具体组成见表1。

表1 实验饲料组成及营养水平（干物质基础，%）

1.3 样品制备与指标测定

1.3.1 样品采集

实验结束前停食24 h，测量平均体长与体重，计算增重率（WGR）、特定生长率（SGR）、存活率（SR）、肥满度（CF）。

随机选取6 尾鱼放入浓度为120 mg/L 的MS-222溶液中进行麻醉，用注射器随机抽取每个养殖桶中4～6 尾鱼的血液注入1.5 mL 离心管中，于4 ℃环境下静置过夜后8 000 r/min 离心10 min，取上清液保存于-80 ℃备用，用于血清生理生化指标的分析。剥离肝脏，保存在-80 ℃中用于肝脏抗氧化指标的检测。取肝脏在冰上解冻，按质量体积比（W/V=1∶9）加入预冷生理盐水，使用电动匀浆机在冰浴条件下进行组织匀浆。4 ℃、3 000 r/min下离心20 min，提取上清液即为粗酶液。

1.3.2 指标测定

1.3.2.1 饲料常规营养成分分析

水分含量的测定采用105 ℃常压干燥法；粗蛋白含量的测定采用微量凯氏定氮法；粗脂肪含量的测定采用索氏抽法；粗灰分含量的测定采用550 ℃马福炉灼烧法。

1.3.2.2 血清生化指标分析

总蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、葡萄糖（GLU）、碱性磷酸酶（AKP）、超氧化歧化酶（SOD）、总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）、谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、二胺氧化酶（DAO）。

1.3.2.3 肝脏生化指标分析

超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、总抗氧化能力（T-AOC）。

以上生理生化指标检测均采用南京建成生物工程研究所有限公司生产的相关试剂盒测定，相应操作均参照说明书进行。

1.3.3 生长性能分析

增重率（WGR，%）=100×(终末重量-初始重量)/初始重量

特定生长率（SGR，%/d）=100×(ln 终末均重-ln 初始均重)/饲养天数

肥满度（CF，g/cm3）=终末均重/终末平均体长3

存活率（SR，%）=100×终末存活尾数/初始尾数

1.3.4 肠道切片处理每个重复取3 尾鱼，分离出中肠于福尔马林试液中固定，室温保存，用于中肠组织切片制作。

1.3.5 数据处理与分析

数据均以“平均值±标准误”表示。用SPSS 26.0软件对所有数据进行单因素方差分析（one-way ANOVA），并进行Duncan’s 法多重比较，以P＜0.05 作为差异显著判断标准。

2 结果与分析

2.1 3 种添加剂对饲喂高含量组胺饲料的黄颡鱼肠道中部的影响

在图1 可知，组胺组的肠道绒毛已经发生破损，而其他实验组的肠绒毛完整；杯状细胞的主要作用是分泌黏蛋白，在肠道的固有屏障中发挥重要作用[17]，组胺可通过作用于杯状细胞膜上的组胺受体引起分泌活动增加，使得杯状细胞数量增加[18]，但在本次实验中组胺对于肠道的屏障产生严重损伤；复合物组的杯状细胞较多，该组对上皮细胞的保护作用最强，且各组的纹状缘比组胺组整齐。

2.2 3 种添加剂对饲喂高含量组胺饲料的黄颡鱼生长性能的影响

由表2 可知，罗伊氏乳杆菌组、复合物组和肉桂醛精油组的终末体重显著高于对照组和组胺组（P＜0.05）。各组之间的肥满度无显著差异（P＞0.05）。复合物组、罗伊氏乳杆菌组、肉桂醛精油组的增重率高于对照组与组胺组，具有显著差异（P＜0.05）。罗伊氏乳杆菌组与复合物组的特定生长率显著高于组胺组、对照组和肉桂醛精油组（P＜0.05），而罗伊氏乳杆菌组与复合物组差异不显著（P＞0.05）。复合物组、罗伊氏乳杆菌组和对照组黄颡鱼存活率显著高于组胺组和肉桂醛精油组（P＜0.05）。

2.3 3 种添加剂对饲喂高含量组胺饲料的黄颡鱼血清生理生化指标的影响

由表3 可知，各组间的黄颡鱼血清总胆固醇、白蛋白、总蛋白和碱性磷酸酶活性没有显著差异（P＞0.05）。组胺组的血清葡萄糖含量最高，与其他组之间具有显著差异（P＜0.05）。肉桂醛精油组的血清三酰甘油含量最高，与对照组、组胺组、罗伊氏乳杆菌组差异显著（P＜0.05），与复合物组差异不显著（P＞0.05）。组胺组的二胺氧化酶活性最高，与其他组差异显著（P＜0.05）；复合物组与对照组、罗伊氏乳杆菌组和肉桂醛精油组差异显著（P＜0.05）。罗伊氏乳杆菌组与复合物组的血清超氧化物歧化酶活性没有显著差异（P＞0.05），这两组与对照组、组胺组、肉桂醛精油组差异显著（P＜0.05）。组胺组血清中的谷丙转氨酶与谷草转氨酶活性最高，显著高于其他组（P＜0.05）。

2.4 3 种添加剂对饲喂高含量组胺饲料的黄颡鱼肝脏抗氧化能力的影响

由表4 可知，复合物组与肉桂醛精油组的过氧化氢酶活性显著高于组胺组(P＜0.05)。组胺组的丙二醛含量最高，与其他组差异显著（P＜0.05）。对照组的超氧化物歧化酶活性最高，显著高于其他组（P＜0.05），组胺组显著低于罗伊氏乳杆菌组、复合物组、肉桂醛精油组（P＜0.05）。

表4 不同添加剂对黄颡鱼幼鱼肝胰腺抗氧化指标的影响

3 讨论

3.1 3种添加剂对黄颡鱼生长性能的影响

日粮中4.00 g/kg 的组胺会降低雏鸡和糠虾（Neomysis awatschensis）的生长速度与存活率[4,19]；饲料中组胺含量在534.00 mg/kg 时显著降低美洲鳗鲡幼鱼的生长性能[20]。黄颡鱼属于有胃鱼，组胺能与黄颡鱼胃肠中的组胺受体结合，高剂量的组胺对黄颡鱼幼鱼产生毒性作用，降低肠道内有益菌群定植，影响黄颡鱼的生理活动与功能，降低了黄颡鱼存活率[5,21]。本次实验中组胺组879.00 mg/kg 的组胺剂量已经对黄颡鱼幼鱼代谢造成严重损伤。在图1 中可以观察到组胺组的肠道绒毛顶端已经发生破损与脱落，罗伊氏乳杆菌组、复合物组与肉桂醛精油组的中部肠道绒毛结构完整清晰，上皮细胞排列紧密，3种添加剂保护了肠道结构的完整性。较高剂量的组胺造成黄颡鱼的肠道严重损伤，会进一步损害黄颡鱼对于营养物质的吸收与机体的抵抗能力下降，消化吸收功能下降，生长受阻。

仔猪的日常日粮中添加罗伊氏乳杆菌（5×1010CFU/kg）可以增加其采食量与日增重[22]。罗伊氏乳杆菌还可以改善氧化应激和营养不足诱导的机体生长抑制[23]，罗伊氏乳杆菌肽聚糖能增加产蛋雏鸡的抗氧化能力与免疫力[24]。现有研究表明黄酮类化合物具有抗氧化、抗炎与降血糖等多种生理作用[25-26]。大豆黄酮能够促进仔猪蛋白代谢增加与机体的氧化能力上升[27]，也可使动物体重的增加与家禽的产蛋性能提高[28-30]。据报道，饲料中添加肉桂醛（300 mg/kg）促进高罗非鱼（Nile tilapia）的生长[31],并提高肉鸡的采食量与日增重[32-33]；肉桂醛本身具有芳香性气味，对黄颡鱼具有诱食作用[34]，可以加速黄颡鱼的摄食反应，提高采食量。在本实验中，罗伊氏乳杆菌、复合物和肉桂醛精油3 种添加剂增加了黄颡鱼对营养物质吸收，体重显著增加。罗伊氏乳杆菌与复合物降低了因组胺造成的死亡率，但是肉桂醛精油对组胺引起的死亡率并没有改善，原因可能是与肉桂醛剂量、动物的种类和年龄有关。

3.2 3 种添加剂的日粮对黄颡鱼血清生理生化指标的影响

转氨酶的主要作用是催化氨基酸生成酮酸，对于动物的机体生命活动具有重要作用。细胞受损会增加细胞膜通透性，肝细胞内的转氨酶被释放到血液中，使得血液中的转氨酶含量升高[35]。二胺氧化酶是组胺在体内分解代谢的主要蛋白酶，二胺氧化酶的活性与黏膜细胞的核酸和蛋白合成密切相关，反映了肠道的完整性和受损伤程度[36]。罗伊氏乳杆菌分泌的黏附素与罗伊氏菌素等物质直接黏附于肠上皮细胞来降低细胞通透性，还可以刺激肠上皮细胞以及肠道紧密连接蛋白的增殖；通过调控肠道菌群代谢产物激活AHR、NF-κB等信号通路，使得抗炎相关蛋白的表达上调，从而增强肠免疫功能[37]。在仔猪日粮中加入罗伊氏乳杆菌（107CFU/L）后，仔猪血浆内的MDA 含 量 降 低，T-AOC、T-SOD 和GSH-Px 活 性 升高[38]。黄酮具有多种生理活性，能捕捉并清除生物体内脂质过氧化的自由基，改善机体内的脂质代谢，减轻细胞内线粒体损伤，调节不同信号通路而发挥保肝作用[39-41]。肉桂醛具有较强的还原性，清除体内多余的自由基以及转录因子Nrf2 的表达，以维持机体的氧化还原反应的平衡[42]。此外，肉桂醛通过下调促炎因子IL-1、IL-6、TNF-α的表达和减少NO、PGE2 以及ROS 的产生达到抗炎作用[43]。组胺组的谷丙转氨酶、谷草转氨酶与二胺氧化酶活性显著高于其他实验组，证明黄颡鱼的肝功能与肠功能已发生严重异常，这一发现与成艳波等[7]研究结果相似。罗伊氏乳杆菌组、复合物组和肉桂醛精油组血清中的谷丙转氨酶、谷草转氨酶和二胺氧化酶的活性显著低于组胺组。罗伊氏乳杆菌、复合物与肉桂醛精油减轻了因组胺带来的肝脏与肠道损伤，具有保护肝脏与肠道的作用，这与其他人的研究成果相似[7，44-45]。

血清中总蛋白的含量是机体营养水平的体现，总蛋白的主要成分是白蛋白与球蛋白。葡萄糖是机体营养状况的指标之一，血液葡萄糖含量越高,表明鱼类摄食越积极,健康状况良好。但当葡萄糖含量超过一定阈值时，会损害鱼体健康[46]。研究表明，罗伊氏乳杆菌能够调节小鼠在高糖高脂饮食下的肝脏FAS和PPARγ基因的蛋白表达，降低血糖血脂的异常升高，改善糖脂代谢紊乱[47]。肉桂醛通过抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性进行调节糖代谢，降低血糖浓度[43]。据报道，肉桂醛可调节2 型糖尿病大鼠体内胰岛素表达与分泌[48]，与改善糖代谢的作用靶点调节机体血糖水平[49]。本实验中，每个处理组之间的白蛋白与总蛋白含量没有显著性差异，表明对于黄颡鱼的蛋白质的代谢并没有产生影响。本实验中组胺造成黄颡鱼机体肝脏与肠道异常，引起肠道与肝脏机能障碍，造成血糖含量显著高于其他实验组，已影响鱼体健康且抑制鱼体生长。罗伊氏乳杆菌组、复合物组和肉桂醛精油组的血糖含量高于对照组，提高了黄颡鱼的生长性能。此外，罗伊氏乳杆菌、复合物与肉桂醛精油等改善了因组胺引起的血糖代谢障碍，使得血清中的葡萄糖含量低于组胺组。

三酰甘油和胆固醇都是血清的主要脂类成分,它们在一定程度上能反映全身的脂类代谢状况，总胆固醇和三酰甘油含量反映了对脂质吸收的状况[50-51]。罗伊斯乳杆菌可以降解胆汁盐，使得机体内胆固醇分解随之排出[52]。大豆黄酮在动物实验中具有降血脂和降低胆固醇的作用[53]。在本实验中，罗伊氏乳杆菌与复合物降低了黄颡鱼血清中胆固醇与三酰甘油的含量，减轻了因组胺带来的血脂代谢的异常影响。然而，肉桂醛精油在黄颡鱼机体内没有表现降低三酰甘油与胆固醇水平反而使两者提高，表明该组黄颡鱼体内的脂质运输与代谢已经发生异常。研究表明，饲料中添加1 000 mg/kg 肉桂醛可降低半滑舌鳎（Cynoglossus semilaevis Gunther）前肠肌层厚度[54]。本实验中肉桂醛精油引起黄颡鱼血液内的三酰甘油含量偏高，原因可能是：①肉桂醛精油在黄颡鱼机体内造成黄颡鱼肠壁的厚度降低，使得黄颡鱼机体脂质消化吸收障碍；②肉桂醛精油使得黄颡鱼机体长期处于氧化应激状态，造成血液内的三酰甘油含量偏高。

3.3 3种添加剂对黄颡鱼抗氧化能力的影响

AKP对于机体的生长具有重要意义，是动物代谢过程中重要的调控酶，它是一种非特异性磷酸水解酶，能催化磷酸单脂的水解及磷酸基团的转移反应[55]。动物机体的肝脏、肠道与骨骼发生病变时，会引起血液中的AKP 活性升高[56-57]。本实验中各组血清中AKP活性没有显著性差异，组胺组的肝脏与肠道已经发生病变，使得血液中的AKP 活性升高，而罗伊氏乳杆菌、复合物与肉桂醛精油一定程度上改善了组胺引起的肝脏与肠道损伤，降低了血液中AKP 的活性。GSH-Px、CAT 与SOD 是生物体内清除体内多余自由基的重要抗氧化酶类，与鱼类的免疫能力有着密切关系[55，58-60]。MDA 作为脂质氧化最终产物，会引起机体多种反应，而且具有细胞毒性，MDA 含量的高低间接反映机体的发生的过氧化程度[61-62]。T-AOC 代表体内酶类和非酶类抗氧化物的总体水平，能全面地反映动物机体的抗氧化状态[63]。GSH-Px、CAT、MDA、SOD 与T-AOC 这几种物质反映了机体内细胞抗氧化能力的强弱。如上所述，本次实验中罗伊氏乳杆菌、复合物与肉桂醛精油降低了黄颡鱼因组胺引起的不良反应。三种物质提高了黄颡鱼因组胺引起肝脏的CAT、SOD、GSH-Px 与T-AOC 的活性，降低了肝脏内MDA 含量，发挥了保肝作用而且提高了黄颡鱼机体的抗氧化能力。

4 结论

879 mg/kg 的组胺剂量对于黄颡鱼生长与存活有着抑制作用。罗伊氏乳杆菌、复合物与肉桂醛改善了黄颡鱼机体的代谢水平，消减了组胺带来的负面影响，增强了肝脏的抗氧化能力，促进了黄颡鱼的生长。