雷州黑鸭EI24基因的遗传多态性及与产蛋性能的相关性分析

潘艺亭,叶润根,赵志辉,姜 平

(广东海洋大学 滨海农业学院,广东 湛江 524088)

中国是鸭饲养大国,饲养量约占世界总量的75%[1]。其中地方鸭种资源丰富,但地方品种的繁殖力较低[2],农民养殖数量增加,但是产出效率却在减少[3],因此减少地方品种资源流失是亟需解决的问题。雷州黑鸭是中国雷州半岛广泛分布的鸭品种,具有适应性强、抗病力强、产蛋高峰期长、蛋龄早、蛋中微量元素丰富、耐粗饲等特点[4]。作为一个优质的地方鸭品种,其遗传多样性是提高肉蛋性能和环境适应性的优良遗传材料。然而,由于农民普遍的自由放养,商业鸭苗随机生产,缺乏规范的人工选育繁殖系统,导致个体品种和羽毛颜色的差异较大。而不稳定的遗传和产蛋数量与质量的下降使雷州黑鸭在市场竞争中处于不利地位。

依托泊苷诱导的2.4蛋白(etoposide-induced 2.4 protein,EI24),又称p53 诱导基因(p53-induced gene 8,PIG8),编码一种定位于内质网(ER)的六跨膜蛋白。有研究者发现,EI24可抑制细胞生长并促进细胞凋亡[5],且EI24的缺失抑制DNA损伤诱导的细胞死亡[6]。DNA损伤时,细胞会启动多种反应途径,以激活DNA修复、细胞周期阻滞和凋亡[7],而DNA损伤反应可导致基因突变和癌症发展[8]。其中DNA损伤反应中的一个关键角色是肿瘤抑制因子p53,在重度DNA损伤时则促进细胞凋亡[9]。而EI24表达受到肿瘤抑制蛋白p53的高度诱导[10],并且在各种癌症中发现EI24经常丢失或突变[11-12]。有研究[13]通过免疫共沉淀和其他体外和体内EI24-Bcl-2的蛋白质与蛋白质结合测定分析表明,EI24利用其N端区域结合Bcl-2中的BH3结构域[14],进而影响细胞凋亡。此外,免疫组织化学分析表明,EI24的缺失与乳腺肿瘤的侵袭性有关[14]。这些结果表明,EI24的诱导有助于细胞凋亡过程,目前主要被认为是用于防止肿瘤扩散[15],这与其一开始作为肿瘤抑制因子的作用一致,同时EI24的mRNA在高低产雷州黑鸭卵巢中的差异表达,可能通过影响卵泡闭锁过程,进而影响雷州黑鸭的繁殖性状。

本试验初步探讨EI24基因的遗传多态性与雷州黑鸭产蛋性能的关系,采用直接测序的方法验证EI24基因的相关分子标记,为挖掘相关遗传标记在雷州黑鸭的标记辅助选择提供依据,为进一步构建雷州黑鸭高产核心群奠定基础。[11]

1 材料与方法

1.1 实验动物300日龄雷州黑鸭92只来自于湛江市坡头区某养殖场的F4代基础群。颈静脉采血2 mL,用肝素抗凝管收集后,-20℃保存备用以提取血液基因组DNA。

1.2 主要试剂及仪器血液DNA提取试剂盒,购自广州美基生物科技有限公司;琼脂糖,购自博格林生物有限公司;Taq Master Mix,购自诺唯赞公司;凝胶成像系统,购自上海天能科技有限公司;快速梯度PCR仪,购自美国ABI公司。

1.3 全基因组DNA提取采用美基DNA提取试剂盒提取血液DNA,步骤参照试剂盒说明书,使用浓度分析仪检测DNA浓度和纯度,-20℃保存备用。

1.4 DNA混池构建随机挑选50个DNA样品进行等量混合,制备成DNA混池样品。

1.5 引物设计根据Ensemble数据库提供的EI24基因组序列(ENSAPLG00030007779),使用Primer 5.0软件进行EI24基因的引物设计,引物由生工生物工程(上海)股份有限公司进行合成:上游引物:5′-GCCTTTGCTGTCGTGATAT-3′;下游引物:5′-ATGTTCCCGTCACCTACCT-3′;

1.6 目的基因PCR扩增及验证PCR反应体系20 μL:DNA模板1 μL,Green Taq Mix 10 μL,上下游引物各0.5 μL,ddH2O 8 μL。

PCR反应程序:95℃预变性3 min;95℃变性15 s,50℃退火15 s,72℃延伸50 s,35个循环;72℃延伸5 min。

进行1%琼脂糖凝胶电泳验证后,送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

2 结果

2.1 雷州黑鸭EI24基因PCR扩增产物验证PCR扩增雷州黑鸭EI24基因产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测,结果显示,PCR产物扩增特异性良好,条带清晰,可直接用于测序鉴定(图1)。

1～6.为随机6个血样DNA的PCR扩增产物;M.DNA Marker

2.2 测序结果EI24基因PCR扩增后,通过引物在内含子5中发现了共7处SNP位点,分别为I5-17 G>T、I5-59 G>A、I5-110 T>A、I5-159 G>A、I5-166 G>A、I5-256 C>A、I5-385 C>T。7个SNPs的每种基因型测序结果如图2～8所示。

1～3.基因型分别为GG、GT、TT的个体

1～3.基因型分别为GG、GA、AA的个体

1～3.基因型分别为TT、TA、AA的个体

1～3.基因型分别为GG、GA、AA的个体

1～3.基因型分别为GG、GA、AA的个体

2.3 EI24基因7个SNP位点的群体遗传特性EI24基因中的7个SNP位点的群体遗传特性见表1。

表1 EI24基因7个SNPs的群体遗传特性

2.4 EI24基因SNPs与雷州黑鸭产蛋性能的相关性分析使用SPSS 22.0软件的单因素方差分析对EI24基因SNPs基因型进行多重比较,结果如表2所示,在I5-17 G>T位点中,TT型的开产日龄显著高于GT型(P<0.05);在I5-59 G>A和I5-159 G>A位点中,AA型的开产日龄均显著高于GA型(P<0.05);在I5-110 T>A位点中,AA型的开产日龄显著高于TA型(P<0.05);在I5-256 C>A位点中,AA型的开产日龄显著高于CA型(P<0.05);在I5-166 G>A位点中,GG型的开产体质量极显著低于AA型(P<0.01),显著低于GA型(P<0.05);在I5-385 C>T位点中,CC型的开产体质量极显著低于TT和TC型(P<0.01);7个SNPs均对开产蛋质量和300 d产蛋量无显著影响(P>0.05)。

表2 EI24基因7个SNPs与雷州黑鸭产蛋性能相关性分析

由以上结果可见,I5-17 G>T、I5-59 G>A、I5-110 T>A、I5-159 G>A和I5-256 C>A这5个位点均与雷州黑鸭开产日龄显著相关;I5-166 G>A和I5-385 C>T这2个位点均与雷州黑鸭开产体质量极显著相关,说明这7个SNPs可能对提高雷州黑鸭的开产日龄和开产体质量有重要参考价值。

2.5 EI24基因单倍型与雷州黑鸭产蛋性能的关联分析使用HaploView 4.2软件对7个SNP位点进行连锁分析,如图9和表3所示,结果显示I5-17 G>T、I5-59 G>A、I5-110 T>A、I5-159 G>A、I5-166 G>A、I5-256 C>A和I5-385 C>T这7个位点都存在强连锁遗传,7个位点构成了一个结构域,共有10种不同的单倍型,其中只有7种单倍型有生物学统计意义(个体数大于3)分别为H1H1(GGGGTTGGAACCTT)、H1H2(GTGATAGA-AACATT)、H1H3(GGGGTTGGAGCCTC)、H1H4(GGGGTTGGAACCTC)、H2H2(TTAAAAAAAAAATT)和H2H3(GTGATAGAGACACT)、H3H3(GGGGTTGGGGCCCC)。

表3 EI24基因单倍型频率

图9 EI24基因7个SNPs位点连锁反应

使用SPSS 22.0软件的单因素方差分析对EI24基因SNPs单倍型进行多重比较,结果如表4所示,H1H4单倍型的开产日龄显著低于H1H1和H2H2单倍型(P<0.05);H3H3单倍型的开产体质量显著低于H1H2、H1H4和H2H2单倍型(P<0.05),并极显著低于H1H1和H1H3单倍型(P<0.01);H1H4单倍型的300 d产蛋量显著高于H1H2单倍型(P<0.05)。7个单倍型均对开产蛋质量无显著影响(P>0.05)。

表4 EI24基因单倍型与雷州黑鸭产蛋性能相关性分析

3 讨论

3.1 雷州黑鸭EI24基因遗传多态性近年来有越来越多的研究人员关注基因多态性对雷州黑鸭产蛋性能的影响,ASIAMAH等[16]采用直接测序法对雷州黑鸭ESR2基因的遗传多态性及产蛋性能的相关性分析发现g.56805646 T>C和exon 3-20 G>A位点与开产蛋质量显著相关。张少伟等[17]使用PCR-SSC方法检测到雷州黑鸭FSHβ基因g.1103451A>T位点的TT型开产日龄均显著低于AA和AT型,而开产体质量和300日龄产蛋数则显著高于AA型,提示该位点可能促进早期产蛋和生长发育而提高雷州黑鸭的产蛋性能。因此,本试验以EI24基因为研究对象,采用直接测序法对EI24基因的单核苷酸多态性进行检测,并分析EI24基因SNPs或单倍型与雷州黑鸭繁殖性状的相关性,在雷州黑鸭EI24基因的内含子5中发现了7处突变位点,并相互连锁,形成强结构域,通过群体遗传多态性分析表明群体处于哈代温伯格平衡。本试验发现雷州黑鸭EI24基因内含子5中的5个SNPs位点均与开产日龄显著相关,2个SNPs位点均与开产体质量极显著相关,提示EI24基因可作为雷州黑鸭开产日龄与开产体质量相关的分子遗传标记。

3.2 雷州黑鸭EI24基因7个SNPs位点与产蛋性能的相关性蛋鸭的开产日龄、开产体质量、开产蛋质量和产蛋数是衡量产蛋性能的重要指标。本试验围绕雷州黑鸭EI24基因,首次发现了该基因内含子5中存在7个SNPs位点,其中I4-17 G>T、I4-59 G>A>T、I4-110 T>A、I4-159 G>A和I4-256 C>A这5个位点均与雷州黑鸭开产日龄显著相关;I4-166 G>A和I4-385 C>T这2个位点均与雷州黑鸭开产体质量极显著相关,说明这7个SNPs可能对提高开产日龄和开产体质量有重要指导作用。

通过SPSS22.0进行相关性分析后发现,开产日龄与开产蛋质量之间存在极显著正相关,与产蛋数之间存在极显著负相关;开产蛋质量与产蛋数之间存在极显著负相关;开产体质量与开产蛋质量之间存在显著正相关。有研究发现产蛋数与开产体质量呈遗传负相关[15],与本次相关性分析结果相符,但H1H4单倍型兼具低开产日龄、高开产体质量和高产蛋量,因此可以从这7个SNPs位点的优势基因型中筛选出低开产日龄、低开产体质量和高产蛋量的个体,从而提高产蛋性能和经济效益。

本试验发现雷州黑鸭EI24基因中I5-17 G>T的GT型、I5-59 G>A与I5-159 G>A的GA型、I5-110 T>A的TA型和I5-256 C>A的CA型可作为低开产日龄的优势基因型;I5-166 G>A的GG型和I5-385 C>T的CC型可作为低开产体质量的优势基因型,为雷州黑鸭分子标记辅助育种及建立优势高产群体奠定了理论基础。

3.3 雷州黑鸭EI24基因的单倍型与产蛋性能的相关性由于SNP分析只能发现保守和非保守分子功能有关的基因,而不能识别相互作用的等位基因连锁遗传,目前更多研究者通过群体结构和个体间差异性关联的连锁不平衡(LD)选育[18]。因此,本试验使用HaploView4.2软件对雷州黑鸭EI24基因的7个SNPs进行了连锁不平衡分析以及使用SPSS 22.0软件对雷州黑鸭EI24基因的7个SNPs的单倍型进行单因素方差分析,发现H1H4单倍型可作为雷州黑鸭群体筛选低开产日龄、高开产体质量和高产蛋量个体的综合最优单倍型,为雷州黑鸭分子标记辅助育种及建立优势高产群体提供了依据。