青藏高原地区牦牛源产气荚膜梭菌流行病学调查及耐药性分析

罗润波,吴 丹,黄家旗,蔡重振,李宇鹏,李 霞,郭晓庆,郭欣冉,宋仁德,索朗斯珠*

(1.西藏农牧学院 动物科学学院,西藏 林芝 860000;2.国家肉牛牦牛产业技术体系玉树综合试验站,青海 玉树 815000)

产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens),又称魏氏梭菌(C.welchii),为革兰阳性、产芽胞的大杆菌,无鞭毛、不运动、两端钝圆、有荚膜,常单个或成双存在。产气荚膜梭菌最适生长温度为42～45℃,对营养要求不高,在普通培养基上可以正常生长,在牛乳培养基上有“爆裂发酵”现象[1]。在血琼脂平板上,菌落为半透明且表面光滑,大多数具有典型的溶血环。该菌可产生α、β、γ、δ、ε、η、θ、ι、κ、λ、μ和ν等20余种细胞毒素,根据分泌毒素种类和致病性的不同,将产气荚膜梭菌分为 A～G 7个毒素型[2]。

产气荚膜梭菌广泛存在于泥土、污水、腐殖质、饲草、排泄物等自然环境以及人畜肠道中,是一种人畜共患性条件致病菌[3]。该菌对健康的肠道黏膜不具有侵袭性和黏附性,由于大量使用抗生素、不合理的饲养管理等干扰因素,打破动物肠道内正常菌群的平衡[4],从而使产气荚膜梭菌在动物肠道中得以大量繁殖并产生不同组合的致病毒素,从而导致动物的胃肠道疾病的发生,给畜牧业造成了巨大的经济损失。牦牛以放牧为主,消毒防疫措施难以实施,牦牛产气荚膜梭菌病春、秋两季多发,是常见的牦牛疾病之一[5-8]。然而关于研究牦牛源产气荚膜梭菌的流行病学和耐药情况的报道很少。因此,中国作为世界上牦牛的主要养殖国家,研究牦牛生产中产气荚膜梭菌的流行情况和耐药特性,对预防和治疗相关疾病具有非常重要的意义。

1 材料与方法

1.1 样品来源在前期的工作中对产气荚膜梭菌引起的牦牛猝死和肠毒血症进行了确诊。本研究样品对病例确诊地区进行了样品的扩大采集和对无产气荚膜梭菌病资料的部分地区进行了样品采集。在2018—2021年从青藏高原地区的规模化牦牛养殖场、散养户随机采集牦牛新鲜粪便样品1 155份。其中包括那曲市(n=295)、拉萨市(n=121)、日喀则市(n=26)、林芝市(n=104)、山南市(n=158)、海北藏族自治州(n=39)、玉树藏族自治州(n=275)和西宁市(n=137)。所有样品低温保存,并及时送西藏农牧学院进行细菌分离培养。

1.2 主要试剂和仪器液体硫乙醇酸盐培养基(FTG)、胰胨-亚硫酸盐-环丝氨酸琼脂培养基(TSC)、梭菌增菌培养基(RCM)、羊血琼脂培养基、Mueller Hinton琼脂、革兰染液购自青岛海博生物技术有限公司;2.5 L厌氧产气袋、厌氧缸购自日本Mitsubishi Chemical公司;无菌脱纤维绵羊血购自北京索莱宝科技有限公司;DNA聚合酶、dNTPs、DNA提取试剂盒购自北京天根生化科技有限公司;核酸染料、DL2000 DNA Marker购自TaKaRa公司;药敏纸片购自杭州微生物有限公司。冷冻离心机、PCR仪,德国Eppendorf公司生产;恒温培养箱,上海博迅实业有限公司生产;凝胶成像系统,上海天能科技有限公司生产;电泳仪,北京八一仪器。

1.3 细菌的分离培养从每份样品中无菌称取1 g牦牛粪便稀释于10 mL的生理盐水中,振荡静置后吸取1 mL上清液接种于FTG培养基,石蜡液封,在43℃条件下培养18～24 h。选取其中有气泡产生的样品接种至含5%环丝氨酸的TSC培养基。随后挑取黑色扁平圆形的单菌落接种于RCM培养基,待培养液混浊后采用三区划线法接种于含5%脱纤维绵羊血的琼脂培养基。挑取有溶血环的单菌落进行革兰染色镜检,并通过菌落形态、细菌形状和生长特性初步判定阳性样品。

1.4 分离菌DNA提取挑取纯化后的单菌落接种于RCM培养基,43℃培养,当培养液D600 nm=0.6～0.8时,按照全菌水煮裂解法制备分离菌DNA模板,-20℃冻存备用。

1.5 分离菌16S rDNA PCR鉴定合成细菌16S rDNA引物[9],27F:AGAGTTTGATCCTGGCTCAG,1492R:GGTTACCTTGTTACGACTT,片段大小为1 465 bp。以分离菌DNA为模板,利用PCR技术对目的基因进行扩增。PCR扩增采用50 μL体系:上游引物1 μL,下游引物1 μL,2×Tap Master Mix酶25 μL,模板2 μL,ddH2O 21 μL。PCR反应程序:94℃ 5 min;94℃ 30 s,55℃ 30 s,72℃ 1 min,30个循环;72℃ 10 min。将PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳,符合目的条带大小的PCR产物委托北京擎科生物科技有限公司成都分公司进行测序。并将测序结果在NCBI网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上的Nucleotide数据库中进行比对。

1.6 分离菌毒素基因检测及分型合成产气荚膜梭菌毒素基因(cpa、cpb、etx、iap、cpe、netB)的引物(表1)。以分离菌DNA为模板,利用PCR扩增技术对分离菌进行毒素基因检测,并根据其所携带的毒素基因按照最新毒素分型方案[4],将其分为A型(cpa)、B型(cpa、cpb、etx)、C型(cpa、cpb)、D型(cpa、etx)、E型(cpa、ia)、F型(cpa、cpe)和G型(cpa、netB) 7个型。

1.7 分离菌药敏试验采用Kirby-Bauer纸片扩散法测定分离菌株对常用的26种抗菌药物的敏感性,用游标卡尺测量抑菌圈大小,参照CLSI推荐的《抗菌药物敏感性试验执行标准》对分离菌的耐药情况进行判定[13]。

1.8 分离菌耐药基因的检测根据文献合成8类33对耐药基因引物(表2),以分离菌DNA为模板,利用PCR技术对分离株的耐药基因进行检测。其中包括抗β-内酰胺类(blaCTX-M、blaSHV、blaTEM、blaOXA)[14]、抗大环类脂类(ermA、ermB、ermC、ermF、ermX)[15]、抗氨基糖苷类(aadA、strA、aph(3′)-III-F、aadB、aphA)[16]、抗四环素类(tetM、tetA、tetB、tetC)[17]、抗氯霉素类(Catl、Flor、cmlA)[18]、抗多肽类(mcr-1、mcr-2、mcr-3、mcr-4、mcr-5)[19]、抗喹诺酮类(qnrA、qnrS、qnrB、aac(6’)-Ib-cr)[20]和抗磺胺类(Sul1、Sul2、Sul3)[21]。

表2 青藏高原地区各地市牦牛源产气荚膜梭菌分离情况

2 结果

2.1 分离菌菌落形态及培养特性分离菌在各培养基生长特性及形态如图1所示。分离菌在FTG中快速产生大量气体,并伴有恶臭气味;在TSC中长出带乳白色晕圈的黑色单菌落;在血平皿上长出具有典型的溶血环的表面光滑、边缘整齐、近似透明的菌落。经过革兰染色镜检可见菌体粗短、成单个或双个排列的革兰阳性直杆菌,大小为(0.6～2.4) μm×(1.3～19.0) μm。

2.2 分离菌16S rDNA PCR鉴定经分离纯化共得到432株疑似产气荚膜梭菌,且分离菌的16S rDNA PCR产物凝胶电泳后在约1 400 bp处出现条带(图2)。将测序结果在NCBI网站上的Nucleotide数据库中比对,432株分离菌与C.perfringens相似性达99.5%～100.0%,确定其为产气荚膜梭菌。

2.3 青藏高原地区各地市牦牛源产气荚膜梭菌分离率青藏高原地区牦牛源产气荚膜梭菌分离情况见表2,结果显示:青藏高原地区牦牛源产气荚膜梭菌平均阳性率为37.40%(432/1155),青海省阳性率为38.14%(172/451)略高于西藏自治区的36.93%(260/704);阳性率最高的地区为西藏那曲市49.83%(147/295),最低为西藏山南市24.05%(38/158)。

2.4 分离菌毒素型鉴定结果青藏高原地区各采样地市牦牛源产气荚膜梭菌分型结果显示:在432株分离菌中检测到了A型(85.65%,370/432)、C型(8.10%,35/432)、D型(4.86%,21/432)和F型(1.39%,6/432) 4种毒素型产气荚膜梭菌,未检测出B型、E型和G型产气荚膜梭菌;A型和C型在青海省和西藏自治区均有检出,D型仅在青海省有检出,F型仅在西藏自治区有检出。

2.5 分离菌的耐药性结果抗生素药物敏感性试验结果显示:分离菌株对红霉素、庆大霉素、卡那霉素、链霉素、多黏菌素B和磺胺甲恶唑6种药物具有较高的耐药性,耐药率为69.44%～93.75%,主要集中于氨基糖苷类抗生素、磺胺类抗生素和少部分大环内酯类抗生素、多肽类抗生素;对头孢噻肟、头孢唑啉、氨苄青霉素、头孢呋辛、头孢他啶、青霉素、头孢氨苄、苯唑西林、麦迪霉素、米诺环素、强力霉素、四环素、克林霉素、氯霉素、氟苯尼考、万古霉素、环丙沙星和氧氟沙星18种药物具有较低的耐药性(图3)。

图3 青藏高原地区牦牛源产气荚膜梭菌药敏试验结果

按省份对分离菌株耐药性进行分析,结果显示:西藏和青海两省份的分离株对不同种类的抗生素药物耐药性基本一致,仅在部分药物的耐药性呈现多样性。两省的分离菌对氨基糖苷类抗生素和磺胺类抗生素的耐药性均超过了65%,其中西藏自治区的分离菌对氨基糖苷类的链霉素耐药率最高,青海省的分离菌对磺胺类抗生素的磺胺甲恶唑耐药率最高。在多肽类抗生素药物中两省对其3种药物的耐药率差异性较大,且西藏分离菌耐药性均高于青海省(图3折线图)。

2.6 分离株的多重耐药性本次药敏试验所使用的抗生素药物分为10类,没有只对1类抗生素耐药的菌株,也没有对10类抗生素都耐药的菌株,其中98.61%的分离菌为多重耐药菌株(对3类及3类以上抗生素具有耐药性)。多重耐药性分析结果显示,青藏高原地区牦牛源产气荚膜梭菌分离株对26种常用抗生素呈现多种耐药现象,且成正态分布,最低可对3种抗生素耐药,最多可对16种抗生素耐药。其中对7种抗生素耐药菌株数量最多占比20.83%,主要表现为耐杆菌肽、庆大霉素、多黏菌素B、红霉素、卡那霉素、磺胺甲恶唑、链霉素;对14,15和16种抗生素耐药菌株数量最少均只占0.69%。另外,对5～8种抗生素耐药的菌株数量超过1/2,多重耐药比高达65.97%。最多的耐药模式为大环内酯类-氨基糖苷类-多肽类-磺胺类,占比16.67%。其余各级耐药菌株占比见图4。

图4 青藏高原地区牦牛源产气荚膜梭菌多重耐药情况

2.7 耐药基因检测采用PCR方法对青藏高原地区分离的产气荚膜梭菌进行33种耐药基因检测。结果显示:分离菌株携带14种耐药基因,检测出率为42.42%(14/33),耐药基因erm(B)检测出率最高,检出率74.01%;耐药基因erm(B)、mcr-2、sul2的检出率在50%以上;耐药基因erm(X)、sul1的检出率30%～50%;耐药基因blaSHV、blaTEM、aph(3')-III-F、tetA、tetB、tetM、Flor、qnrS、aac(6’)-Ib-cr的检出率15%以下;其余19种耐药基因未检出(图5)。表明青藏高原地区分离的产气荚膜梭菌携带多种耐药基因。

图5 青藏高原牦牛源产气荚膜梭菌各耐药基因的检出率

2.8 细菌的耐药表型和耐药基因型相关性分析对分离的牦牛源产气荚膜梭菌的耐药表型和耐药基因型进行相关性分析,结果显示,大环内酯类、氯霉素类、磺胺类抗生素的耐药表型和耐药基因型的符合率为90% 以上;β-内酰胺类、四环素类、多肽类、喹诺酮类抗生素的耐药表型和耐药基因型的符合率为80%～90%;氨基糖苷类抗生素的耐药表型和耐药基因型的符合率稍低,为14.81%(表3)。以上表明,在青藏高原地区分离的产气荚膜梭菌的耐药表型和耐药基因之间具有较强的相关性。

表3 青藏高原牦牛源产气荚膜梭菌耐药表型和耐药基因型相关性分析结果

3 讨论

产气荚膜梭菌是一种重要的人兽共患病原菌,其引起的疾病在全球都有发生,严重危害着各国畜禽业的发展。本研究从青藏高原地区采集牦牛粪样1 155份,通过分离培养、革兰染色镜检和16S rDNA鉴定,得到432株产气荚膜梭菌,阳性率为37.40%,青海省阳性率为38.14%,略高于西藏自治区的36.93%。总的来说,肠道通常是产气荚膜梭菌的主要栖息地,但其阳性率的高低通常受到宿主动物生活环境的影响。另外,青藏高原地区海拔高、气温低、湿度低、紫外线强、空气颗粒污染物较少,细菌缺少可依附载体,为细菌的繁殖和传播造成了一定阻碍,同样影响着产气荚膜梭菌阳性率的变化[22]。

产气荚膜梭菌所产生的毒素可引起牦牛坏死性肠炎、下痢、气性坏疽和猝死。在本研究中,从432株分离菌中检测到了A、C、D和F型4种毒素型产气荚膜梭菌,未检测出B、E和G型产气荚膜梭菌。其中A和C型在青海省和西藏自治区均有检出,D型仅在青海省有检出,F型仅在西藏自治区有检出。A型产气荚膜梭菌数量最多,占比85.65%,具有一定的优势性,与吴丹等[23]、罗润波等[7-8]对牦牛源产气荚膜梭菌的研究结果相同;A型产气荚膜梭菌可引起人食物中毒,携带A型产气荚膜梭菌的牦牛可能是人类和动物的潜在感染源,应引起重视;C型产气荚膜梭菌占比8.10%,其所含的cpb毒素具有细胞毒性和致死性,当宿主生活环境发生不适变化或机体健康状况下降时该菌大量增殖并产生毒素,常引起牦牛腹泻、坏死性肠炎、肠毒血症以及猝死等疾病[24]。另外,本研究首次报道从青藏高原牦牛粪样中检测到D和F型产气荚膜梭菌。D型产气荚膜梭菌占比4.86%,已知D型可引起牛、绵羊、山羊的肠毒血症甚至导致突然死亡并可能在犊牛疾病中发挥作用[25]。F型产气荚膜梭菌数量最少占比1.39%,其所含有的cpe毒素在产气荚膜梭菌群体中被认为是罕见的(0～5%)与人类肠道疾病有关,在某些情况下,会导致食物中毒、抗生素相关性腹泻(AAD)和散发性腹泻(SD)[26]。本研究对青藏高原牦牛源产气荚膜梭菌毒素基因的检测结果丰富了牦牛源产气荚膜梭菌毒素型,表明了牦牛源产气荚膜梭菌毒素基因型的多样性。

本研究中,我们对432株分离菌做了26种药物的敏感性测试。药敏试验所使用的抗生素药物分为10类,其中98.61%的分离菌为多重耐药菌株(对3类及3类以上抗生素具有耐药性),最多可对16种抗生素耐药,其中对7种抗生素耐药菌株数量最多占比20.83%,主要表现为耐杆菌肽、庆大霉素、多黏菌素B、红霉素、卡那霉素、磺胺甲恶唑、链霉素。最多的耐药模式为大环内酯类-氨基糖苷类-多肽类-磺胺类,占比16.67%。对红霉素、庆大霉素、卡那霉素、链霉素、多黏菌素B和磺胺甲恶唑6种药物具有较高的耐药性。在没有进行抗生素敏感性测试的情况下,人类和兽医过度使用或误用抗生素,这可能是抗生素多重耐药性增加的一个主要因素[27]。提示我们在临床实践应用中,应当科学合理地用药,防止病原菌产生耐药性。

根据本研究结果提示青藏高原地区牦牛源产气荚膜梭菌具有多样性和多重耐药性,并且流行比较广泛。产气荚膜梭菌病传染性强,发病迅速,通常来不及治疗。临床上抗菌药物和高免疫血清都没有太大的治疗价值,给药以后往往对于机体内新繁殖的细菌具有抑制或者杀灭作用,对已产生的外毒素作用不大,无法进行有效的治疗干预。良好的饲养管理是预防该病的最佳方法。