强心汤对OMA1封闭心力衰竭大鼠心肌组织Caspase-3、Bax、Bcl-2表达的影响

陈文鹏,卢健棋,庞 延,朱智德,潘朝锌,温志浩,梁逸强,卢俊燊,许志亮

慢性心力衰竭(chronic heart failure,CHF)是心脏结构和(或)功能异常导致肺循环和(或)体循环淤血,以活动耐量下降、水钠潴留和呼吸困难为表现的一种临床综合征,是各种心血管事件的终末阶段。随着人口老龄化、肥胖等心血管疾病危险因素不断突出,心力衰竭的死亡率和再住院率居高不下,被认为是21世纪心血管领域的重大公共卫生挑战[1]。2021年《中国心血管健康与疾病报告2020》[2]指出目前我国心力衰竭的患病率为1.3%,较2000年增加了44.0%,根据推算目前我国约有890万例心力衰竭病人,众多的心力衰竭病人给社会和家庭带来了沉重的经济负担和养护负担。中药多途径、多靶点、多机制的作用在防治CHF方面取得了一定成效,中药通过保护心脏线粒体功能,参与线粒体能量代谢和保护心肌得到了众多研究验证。强心汤作为广西名中医卢健棋教授临床治疗CHF的有效验方,长期应用于广西中医药大学第一附属医院心血管科CHF的临床防治中[3-4],并且取得了较满意的临床疗效。本课题组前期动物实验研究已证实,强心汤能够抑制金属蛋白酶相关蛋白1(OMA1)表达,降低线粒体内膜蛋白酶1(OPA1)水解,保护心肌细胞的线粒体形态和功能从而改善心功能[5]。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3)、Bcl-2家族相关x蛋白(Bax)、B细胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell lymphoma/leukemia-2,Bcl-2)等相关调控蛋白在强心汤调控心肌线粒体代谢,改善心功能可能作用机制发挥着重要作用。本研究以急性心肌梗死后大鼠为CHF动物模型,初步探讨强心汤防治CHF可能作用及机制,为益气温阳、活血利水法防治CHF提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 动物与病毒

选取清洁级5～6周龄健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠50只,体质量200～230 g,购自湖南思莱克景达实验动物有限公司,生产许可证号:SCXK(湘)2019-0004。OMA1 RNAi腺病毒质粒由上海吉凯基因科技有限公司提供。

1.2 药物

强心汤药物组方:黄芪30 g,党参15 g,柏子仁(打碎)12 g,白附片(先煎)、桂枝、川芎、丹参、葶苈子、茯苓、白术、玉竹各10 g,炙甘草6 g。以上药物由广西中医药大学第一附属医院药学部中药房提供,并由中药煎药室通过水煮醇沉标准工艺制成生药含量为1 mg/mL的浓缩煎剂。

1.3 试剂与仪器

Trizol regent(Solarbio公司,货号:R1100);TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ、PCR Forword Primer、PCR Reverse Primer(Takara公司,货号:RR820A);高效RIPA组织裂解液(Solarbio公司,货号:R0010);蛋白酶抑制剂混合液(Solarbio公司,货号:P6730);Loading Buffer(Solarbio公司,货号:P1016);脱脂奶粉(Solarbio公司,货号:D8340);增强型化学发光(ECL)底物(超敏)(Biosharp公司,货号:BL523A)。低温离心机(德国Eppendorf公司,货号:5418R);水平摇床(中国其林贝尔公司,货号:TS-3D);小型动物呼吸机(中国普升科技有限公司,型号:RSP-1002);超微量核酸检测仪(中国遂真公司,货号:FC-1100);VeritiTM96-Well Thermal Cycler(美国Applied Biosystems®,货号:4375786);蛋白转印模块(美国Bio-Rad公司,货号:Mini Trans-Blot Cell);凝胶成像系统(中国上海天能公司,货号:Tanon 5200);二维超声心动图仪(美国Esaote公司,型号:Mylab 50)。

1.4 建立CHF大鼠模型

参照文献[6]方法,采用结扎SD大鼠冠状动脉左前降支中上段建立CHF模型,假手术组大鼠冠状动脉前降支穿线但不结扎,其余操作同CHF造模方法。成功造模后将大鼠送回笼中常规饲养,2周后心脏彩超检查提示左室射血分数(left ventricular ejection fraction,LVEF)下降20%～30%可判断为造模成功。

1.5 实验分组及干预方法

参考文献[5],按随机数字表法将50只大鼠平均分为5组,分别为假手术组、模型组、OMA1封闭组、强心汤组、OMA1封闭+强心汤组,分组完成后采用结扎冠状动脉方法进行造模,其中封闭组在建立模型前第1天和建模后第7天各尾静脉注射2×1010pfu OMA1干扰腺病毒对大鼠OMA1表达封闭,CHF大鼠模型建立成功后第2天开始,强心汤组、OMA1封闭+强心汤组给予强心汤混悬液临床等效剂量每次1.62 g/kg灌胃[7],其余各组给予生理盐水2 mL灌胃,每日2次。各组均灌胃观察28 d。

1.6 观察指标及方法

1.6.1 心功能指标

用心脏彩超检测各组大鼠的左室舒张末期内径(left ventricular end-diastolic diameter,LVEDD)、左室收缩末期内径(left ventricular end-systofic diameter,LVESD)、LVEF心功能指标,具体方法参见文献[5]内容。

1.6.2 心肌组织OMA1及Caspase-3、Bax、Bcl-2相关蛋白表达

各组SD大鼠干预4周经处死后取出心肌组织,包埋、切片处理后采用二喹啉甲酸法测定蛋白含量,再通过胶层分离→转膜→封闭(5% 脱脂奶粉)→抗体稀释→抗体孵育→TBST洗膜→ECL显色后曝光成像,经Image J 1.52对条带定量分析,各指标灰度值经β-actin均一化,计算蛋白相对表达量,具体步骤参照文献[7]。

1.6.3 心肌组织 OMA1及Caspase-3、Bax、Bcl-2 mRNA表达

根据Trizol试剂盒说明书提取大鼠心肌组织RNA,按PrimeScriptTMRT Master Mix操作指示进行反转录聚合酶链式反应(qRT-PCR)。引物序列,OMA1:正向 CGCGCTCACGATAACCAAG,反向GCCAGCGTAT-TCACTCCAGA,片段长度:97 bp;Caspase-3:正向GAAAGCATCCAGCAATAGGC,反向AGCGATGACTCAGCACCTCC,片段长度:125 bp;Bax:正向TGCTACAGGGTTTCATCCAGG,反向GAGACACTCGCTCAGCTTCTTG,片段长度:113 bp;Bcl-2:正向TGTGGCCTTCTTTGAGTTCG,反向CATCCCAGCCTCCGTTATCC,片段长度:97 bp;ATCB(内参):正向CGTAAAGACCTCTATGCCAACA,反向TAGGAGCCAGGGCAGTAATC,片段长度:100 bp。引物由广西医科大学睿谷医学检验有限公司提供。各基因表达的相对定量采用2-△△Ct法进行计算。

1.7 统计学处理

2 结 果

2.1 各组大鼠心功能指标比较

与假手术组比较,模型组大鼠LVEDD、LVESD均升高(P<0.05),LVEF降低(P<0.05);与模型组比较,OMA1封闭组、强心汤组、OMA1封闭+强心汤组大鼠LVEDD、LVESD均降低(P<0.05),LVEF升高(P<0.05);强心汤组大鼠LVEDD、LVESD高于OMA1封闭组、OMA1封闭+强心汤组(P<0.05),LVEF低于OMA1封闭组、OMA1封闭+强心汤组(P<0.05);与OMA1封闭组比较,OMA1封闭+强心汤组大鼠LVEDD、LVESD低于OMA1封闭组(P<0.05),LVEF高于OMA1封闭组(P<0.05)。详见表1。

表1 各组大鼠心功能指标比较

2.2 各组大鼠心肌组织OMA1及Caspase-3、Bax、Bcl-2 mRNA表达水平

与假手术组比较,模型组大鼠心肌组织中OMA1、Bax、Caspase-3 mRNA表达明显升高(P<0.05),Bcl-2 mRNA表达明显降低(P<0.05);与模型组比较,OMA1 封闭组、强心汤组、OMA1 封闭+强心汤组大鼠心肌组织OMA1、Bax、Caspase-3 mRNA表达降低(P<0.05),Bcl-2 mRNA表达升高(P<0.05);与强心汤组比较,OMA1封闭组、OMA1封闭+强心汤组大鼠心肌组织OMA1、Bax、Caspase-3 mRNA表达降低,Bcl-2 mRNA表达升高(P<0.05);与OMA1封闭组比较,OMA1封闭+强心汤组大鼠OMA1、Caspase-3、Bax mRNA表达水平降低(P<0.05),Bcl-2 mRNA表达升高(P<0.05)。详见表2。

表2 各组大鼠心肌组织OMA1及Caspase-3、Bax、Bcl-2 mRNA表达

2.3 各组大鼠心肌组织OMA1、Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表达水平

与假手术组比较,模型组大鼠心肌组织OMA1、Caspase-3、Bax 蛋白表达升高(P<0.05),Bcl-2蛋白表达降低(P<0.05);与模型组比较,OMA1封闭组、强心汤组、OMA1封闭+强心汤组大鼠心肌组织 OMA1、Caspase-3、Bax蛋白表达降低(P<0.05),Bcl-2蛋白表达升高(P<0.05)。与强心汤组比较,OMA1封闭组、OMA1封闭+强心汤组大鼠OMA1、Caspase-3、Bax蛋白表达降低(P<0.05),Bcl-2蛋白表达升高(P<0.05);与OMA1封闭组比较,OMA1封闭+强心汤组大鼠OMA1、Caspase-3、Bax 蛋白表达低于OMA1封闭组(P<0.05),Bcl-2蛋白表达高于OMA1封闭组(P<0.05)。详见表3、图1。

图1 各组大鼠心肌组织OMA1、Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表达电泳图

表3 各组大鼠心肌组织OMA1及Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表达比较

3 讨 论

中医学根据CHF临床症状将其归为“心水”“喘证”“水肿”等中医疾病范畴,中医学认为“心者君主之官,主血主脉”,心衰日久,其气必虚,虚则血行无力,神形失养,血不行则瘀,瘀停则水饮聚,血瘀、水饮皆为阴邪,易滞气机,气机运化不调遂出现水肿、喘咳、乏力、纳差等症,最终发为心衰病。陈可冀专家组在《慢性心力衰竭中西医结合诊疗专家共识》[8]中提出CHF的病性为本虚标实,基本病机概括为“虚”“瘀”“水”,心气虚为病之本,基本治法为“益气温阳、活血利水”。强心汤是广西中医药大学第一附属医院治疗CHF的有效经验方,方中黄芪、白附片、党参、桂枝补气温阳统摄全方,茯苓、玉竹、白术养阴健脾益气,丹参、川芎活血行气化瘀,柏子仁宁神养心,葶苈子利水泻肺,炙甘草调和诸药,各药共奏益气温阳、活血利水之效。

近年来,国内外发表的相关文献报道显示,当前CHF治疗早已不是简单局限在传统的强心、利尿、扩张血管方案,CHF的研究已向神经激素拮抗剂、延缓心室重塑、多靶点治疗理念转变[9-10]。随着沙库巴曲缬沙坦等血管紧张素受体脑啡肽酶抑制剂(angiotensin receptor neprilysin inhibitor,ARNI)、依帕列净、恩格列净等钠-葡萄糖共转运体2抑制剂(sodium-dependent glucose transporters 2,SGLT2)等新型药物的研发应用,CHF的治疗方案由“黄金三角”过渡到以血管紧张素转换酶抑制剂(angiotensin converting enzyme inhibitor,ACEI)/ARNI为基础的“新三角”,再到如今的“新四联”(ACEI/ARNI、β受体阻滞剂、SGLT2、醛固酮受体拮抗剂)方案,CHF病人的症状控制与预后得到了明显改善,但这些药物治疗仍然受到低血压、心动过缓、肝肾功能异常等因素影响,临床应用常受到一定限制[11-13]。

水液潴留、血流动力学异常、神经内分泌异常这些机制并不能完全解释CHF病理生理的复杂性,心肌线粒体功能和能量代谢与CHF的关系逐渐受到重视,保护心肌线粒体功能,改善心肌能量代谢成为防治CHF新思路[14]。线粒体是心肌细胞中含量最多、功能最重要的细胞器,被称为细胞的“动力源”,心肌线粒体通过不断地分裂、融合和形态改变,适应各种应激条件为心脏的收缩和舒张提供能量[15]。以三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)合成减少、活性氧生成增加、Ca2+稳态失衡、线粒体分裂与融合失调为主要特征的线粒体功能障碍会导致广泛的心肌细胞损伤甚至凋亡,引起心肌的能量供需失调,最终导致心力衰竭[16-18]。据研究报道,OMA1在线粒体融合和分裂过程中扮演着重要角色,当心肌缺血缺氧时,OMA1能够促进心肌线粒体裂解并激活Bax、Caspase-3细胞凋亡因子表达,诱导心肌细胞凋亡,促进了心肌纤维化和心室重塑的进程[19-20]。此外,处于心肌细胞线粒体上游的Bcl-2、Bax通过调控线粒体的形态与功能,介导调控细胞凋亡相关活性物质释放,进而参与心肌细胞凋亡,Bcl-2在此过程中发挥抑制凋亡作用,而Bax起到促凋亡作用,二者相互制约、相互联系。综上可见,OMA1、Bcl-2、Bax、Caspase-3在调控心肌细胞凋亡过程中发挥着重要的作用。

线粒体在心脏中含量丰富,约占心肌细胞器近30%,通过氧化磷酸化为心肌收缩和舒张功能提供约90%的ATP能量供应,此外,心肌细胞的生长和凋亡的调节同样与心肌线粒体相关[21-22]。在心肌线粒体中Bcl-2家族蛋白Bcl-2、Bax的表达水平与心肌细胞凋亡调控有关,在线粒体能量代谢平衡的条件下,抗凋亡蛋白Bcl-2能够阻断Bax的促凋亡作用,当这种稳态被打破后,促凋亡Bax蛋白寡聚化后在线粒体外膜聚集使得线粒体外膜通透性发生改变导致细胞色素C(Cyt-C)过度释放,与此同时OMA1被激活后切割OPA1,OPA1切割触发线粒体嵴重构,使嵴内的更多的Cyt-C被释放[23]。OMA1作为调节线粒体融合与分裂的一种金属内肽酶,在线粒体膜间的空间中具有蛋白水解活性,当心肌发生缺血缺氧时,OMA1以依赖应激的方式在S1裂解位点裂解OPA1生成可溶性短链蛋白S-OPA1,过量的S-OPA1生成会导致线粒体裂解,促进Bax寡聚化,干扰Bcl-2的生成,改变线粒体外膜通透性,促进Cyt-C释放到细胞质中,激活下游Caspase级联反应,Caspase-3活化,最终诱导细胞凋亡;而且OMA1裂解OPA1离不开Bcl-2、Bax等凋亡因子的特异性激活,在参与线粒体凋亡和细胞凋亡的机制中OMA1、Bcl-2、Bax相互影响,与CHF的发生密切相关[24-26]。本实验结果显示,强心汤和OMA1封闭均能够下调OMA1、Bax、Caspase-3的mRNA和蛋白表达,上调Bcl-2的mRNA和蛋白的表达,从而改善心功能,其中OMA1封闭+强心汤组疗效最明显,据此推测强心汤可能与OMA1基因封闭在调节心肌细胞凋亡中能够发挥协同作用。

本研究中通过采用结扎冠状动脉左前降支方法建立大鼠CHF模型,强心汤灌胃、基因封闭干预处理后应用超声检测各组大鼠心功能,结果显示:相比假手术组,模型组大鼠LVEDD、LVESD升高,LVEF降低,与模型组比较,其他各干预组大鼠LVEDD、LVESD均下降,LVEF均升高;各干预组相比,OMA1封闭+强心汤组LVEDD、LVESD最小,LVEF最高,OMA1封闭组次之,强心汤组心功能指标改善情况差于OMA1封闭组,表明强心汤可改善CHF模型大鼠心功能。

综上所述,强心汤可以明显改善CHF模型大鼠的左室心功能指标,能够显著下调CHF模型大鼠心肌组织中OMA1、Bax、Caspase-3表达,上调Bcl-2表达,揭示了强心汤调控心肌线粒体代谢,改善心功能可能的作用机制,为强心汤的开发及临床应用提供了依据。但由于本研究样本量和基因数量较少,通路单一,未来仍需进一步增大样本量和延长干预时间期限,从多分子、多基因、多蛋白、多通路等方面对强心汤治疗CHF做进一步深入研究。