不结球白菜类胡萝卜素裂解双加氧酶基因BrCCD4a的克隆及表达分析

尹 莲, 孙玉东, 陈龙正, 罗德旭, 任旭琴, 王林闯, 许文钊, 于雯雯,刘 璐, 赵建锋

(1.江苏徐淮地区淮阴农业科学研究所,江苏 淮安 223001;2.淮安市设施蔬菜重点实验室,江苏 淮安 223001;3.江苏省农业科学院蔬菜研究所,江苏 南京 210014;4.淮阴工学院生命科学与食品工程学院,江苏 淮安 223003)

类胡萝卜素是自然界广泛存在的脂溶性色素,也是重要的次生代谢产物[1]。类胡萝卜素参与植物生长和发育的许多过程,其种类和含量与植物植株呈色、产量及品质密切相关[2-3]。

类胡萝卜素裂解双加氧酶(CCD)是植物类胡萝卜素裂解酶的重要成员,其裂解功能在脱辅基类胡萝卜素及色素形成过程中发挥重要作用。CCD4酶存在于质体中,以紫黄质、叶黄素、β-胡萝卜素、β-隐黄质和玉米黄质等为底物,是许多植物呈色的决定因素[4]。刘晓丛等[5]从万寿菊中克隆获得TeCCD4b基因,发现TeCCD4b蛋白主要分布在质体膜上,可以增加接触底物的机会,有助于类胡萝卜素降解从而导致万寿菊花瓣颜色变浅。王昊等[6]对芹菜AgCCD4基因进行克隆和表达分析,发现AgCCD4基因的表达量与类胡萝卜素含量负相关,表明该基因可能通过降解类胡萝卜素来调控芹菜植株着色。Bai等[7]通过病毒引导的基因沉默(VIGS)技术敲除白果肉桃CCD4基因,发现桃果肉中叶黄素、β-胡萝卜素和β-隐黄质等黄色色素积累量上升,果肉黄化,说明CCD4基因在白桃果实呈色方面起重要作用。贾乐东[8]在甘蓝型油菜黄花品种中超表达BnaC03.NCED4基因后,花瓣颜色由黄变白,证明该基因能调控花瓣的着色。此外,柑橘、大白菜和桂花等作物的CCD4基因克隆及功能研究也有类似报道[9-11]。

不结球白菜(BrassicacampestrisL.ssp.chinensisMakino)是十字花科芸薹属的叶菜类植物,俗称小白菜,含有丰富的矿物质和维生素。不结球白菜品种丰富,颜色多样,不同品种间形态差异明显[12]。王真真等[13]分析了不结球白菜花芽分化过程中叶绿体色素含量的动态变化。目前关于CCD基因在不结球白菜叶片类胡萝卜素调控中的作用未见报道。

本研究拟克隆不结球白菜CCD基因——BrCCD4a基因,分析BrCCD4a蛋白氨基酸序列、理化性质及BrCCD4a基因空间表达和亲缘关系;然后选取3个颜色差异明显的不结球白菜品种,通过叶片类胡萝卜素含量及BrCCD4a基因的相对表达水平测定,探究BrCCD4a基因在不结球白菜叶片着色中的作用。以期为分子层面探究不结球白菜类胡萝卜素代谢机制提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验在江苏省淮安市农业科学院科研创新基地(33°50′N,119°05′E)进行。试验材料为浅绿品种HB02、深绿品种SX04和紫色品种NN2108,种质资源保存于淮安市设施蔬菜重点实验室。HB02是矮脚黄类型白菜,叶色黄绿,叶形近圆,叶柄为白色;SX04是苏州青类型白菜,叶色深绿,叶片光泽度高,叶形近圆,叶柄为绿色,植株较矮小;NN2108是青梗菜类型白菜,叶片为紫色,叶形阔椭圆,叶柄白绿色,株型较大且产量较高(图1)。于2021年9月10日使用穴盘育苗,每穴播1粒种子,播后用基质覆盖。10月5日将幼苗移栽定植于田间,试验地每667 m2施入复合肥(N∶P2O5∶K2O=15∶15∶15) 40 kg。定植行株距为25 cm×25 cm。该试验以每个品种为一个区组完全随机排列,各品种均设置3次重复。播种后55 d每个品种选取长势一致的健康植株3株,取其叶片部位,用液氮速冻后置于-80 ℃冰箱保存备用。

图1 不同颜色的不结球白菜品种

烟草(本氏烟)种子保存于本实验室,在光照培养箱中(白天25 ℃ 16 h,夜晚18 ℃ 8 h;30 000 lx)培养用于后续试验。大肠杆菌菌株DH5α、农杆菌菌株GV3101、载体pCAMBIA-1301和pSPYE均由本实验室保存,高保真酶PrimeSTAR Max Premix为日本TaKaRa公司产品,荧光定量PCR酶采购于上海翊圣生物科技有限公司。叶黄素和β-胡萝卜素标准品均购于上海源叶生物科技有限公司。

1.2 BrCCD4a的克隆

依据不结球白菜转录组基因序列[14],利用Primer Premier 6.0设计BrCCD4a的克隆引物,正向引物序列5′-ATGGACTCTCTTTCTTCCTCTTCCT-3′,反向引物序列5′-CTAAAGCTTATTAAGGTCACTCTC-3′。使用20 μl PCR反应体系:高保真酶10 μl,ddH2O 7 μl,cDNA模板1 μl,上、下游引物各1 μl。扩增程序为:98 ℃预变性10 s;98 ℃变性10 s,55 ℃退火10 s,72 ℃延伸10 s,共35个循环;最后72 ℃延伸 10 min。PCR扩增产物使用琼脂糖凝胶电泳进行检测大小,回收后送至生工生物工程上海(股份)有限公司进行测序。测序后将正确的序列构建到pCAMBIA-1301载体上获得BrCCD4a-pCAMBIA-1301重组质粒,然后转化至大肠杆菌DH5α中扩繁,并进行测序验证。

1.3 序列生物学分析

依据测序结果,利用BioXM软件分析BrCCD4a基因编码氨基酸序列。在美国国家生物技术信息中心(NBCI)数据库找到拟南芥(O49675.1)、水稻(Q69NX5.1)、黄芩(AGN03860.1)、长筒石蒜(AXQ00539.1)、甘蓝(QBR98072.1)、桃(AGL08676.1)、白屈菜(UOL49148.1)、芹菜(UDO48187.1)、茶树(AYK03325.1)、洋水仙(AZP54317.1)、牵牛(FAA01245.1)、烟草(AKO22632.1)、玫瑰(AKT74335.1)、黑果枸杞(AIX87534.1)、苦瓜(AFU91490.1)和桂花(ABY60887.1)等物种的CCD4氨基酸序列,利用NCBI CDD(Conserved Domain Database)数据库中保守结构域搜索功能(CD-search)对BrCCD4a保守域进行预测,并利用MEGA7.0软件,设置Bootstrap为1 000,采用邻近法构建系统进化树。使用DNAMAN 8.0进行亲/疏水性分析及不结球白菜与上述物种的CCD4氨基酸序列比对。氨基酸组成、蛋白质相对分子质量和等电点分析采用Prot Param在线软件(https://web.expasy.org/protparam/)进行。利用SOPMA在线软件(http://pbil.ibcp.fr/)分析BrCCD4a蛋白二级结构,通过SWISS-MODEL网站建立蛋白质三级结构。使用Signal P 软件进行信号肽预测。

1.4 不结球白菜叶片中类胡萝卜素含量测定

叶黄素和β-胡萝卜素是两类重要的类胡萝卜素,分布广泛,在不结球白菜中含量较高。利用液相色谱仪进行叶黄素含量和β-胡萝卜素含量的测定。在研钵中迅速加入液氮将不结球白菜叶片研磨成粉末,然后使用Christ ALPHA 2-4 LD plus冷冻干燥机(德国Marin Christ公司产品)将样品冻干。称取50 mg样品置入装有丙酮的5 ml离心管中,在50 ℃水浴锅中浸提至无色后将所有浸提液收集于10 ml离心管中,用0.45 μm过滤器过滤。使用UPLC超高效液相色谱仪(日本Shimadzu公司产品)对提取液进行检测。色谱柱规格为250.0 mm×4.6 mm,流动相为体积比10∶90的甲醇和乙腈混合溶液,流速为1 ml/min,柱温设置为30 ℃,洗脱吸光度为450 nm。分别配制1 μg/ml、5 μg/ml、10 μg/ml、50 μg/ml、100 μg/ml和250 μg/ml的叶黄素和β-胡萝卜素标准品溶液,以标准品质量浓度为横坐标,标准品峰面积为纵坐标绘制标准曲线,进样后通过比较样品与标准品的保留时间鉴定类胡萝卜素的种类,根据检测到的样品积分峰面积代入标准曲线计算类胡萝卜素含量。每个样品设置3个重复。

1.5 亚细胞定位

使用Primer Premier 6.0设计特异引物 5′-ACGGGGGACTCTAGAGGATCCATGGACTCTCTTT￣C￣T￣T￣C￣C￣T￣C￣T￣T￣C￣C￣T￣-3′和5′-GCCCTTGCTCACCATGGATCCAAGCTTATTAAGGTCACTCTC-3′扩增BrCCD4a的cDNA序列,然后插入带有绿色荧光蛋白基因(EGFP)的表达载体pSPYE中,获得BrCCD4a-EGFP重组质粒,测序验证正确后通过电转化将重组质粒导入农杆菌。挑选成功转化的菌株于YEB培养基中,28 ℃摇床培养,待OD600为0.5时立刻离心菌液,然后加入30 ml缓冲液(10 mmol/L 2-吗啉乙磺酸3 ml,10 mmol/L氯化镁3 ml、150 μmol/L乙酰丁香酮30 μl,ddH2O 23.97 ml)洗菌,离心重悬后将OD600调节为0.8。于室温下避光放置4 h,然后使用注射器将悬液注射入30 d苗龄的烟草叶片背面[15],培养5 d后,使用Zeiss LSM 780激光共聚焦扫描显微镜(德国Zeiss公司产品)观察蛋白质定位情况。

1.6 不同品种BrCCD4a基因表达水平分析

使用CFX 96 Touch系统(美国Bio-rad公司产品)进行实时荧光定量PCR反应。选用不结球白菜Actin作为内参基因(登录号:Bra022356),正向引物序列为5′-CTGTGACAATGGTACCGGAATG-3′,反向引物序列为5′-ACAGCCCTGGGAGCATCA-3′。根据BrCCD4a序列特征,利用Primer Premier 6.0设计定量引物,正向引物序列为5′-TCGGAGATTCAGATTCGGATGAGGA-3′,反向引物序列为5′-GGAGCGATGAGAACGATGGTGTC-3′。扩增程序为:95 ℃预变性30 s;95 ℃变性5 s,60 ℃退火30 s,40个循环;熔解曲线分析范围为65 ℃到95 ℃,每隔5 s增加0.5 ℃。每个PCR反应设置3次重复。采用2-△△Ct法分析基因相对表达量[16]。

1.7 数据处理

利用SPSS(26.0)软件选择Duncan’s法进行处理间差异显著性分析。使用Microsoft Excel 2007软件对基因表达水平进行作图。

2 结果与分析

2.1 BrCCD4a基因序列与进化分析

测序结果表明,BrCCD4a基因含有1个1 797 bp的开放阅读框(ORF),编码598个氨基酸。保守域预测显示BrCCD4a与NCED(9-cisepoxycarotenoid dioxygenase)有相同的保守结构域,属于CCD蛋白家族(图2A)。CCD4氨基酸序列比对结果显示不结球白菜与甘蓝、拟南芥和桂花相似度较高,分别为86.19%、85.36%和68.24%(图2B)。系统进化分析结果表明,不结球白菜BrCCD4a与甘蓝和拟南芥的进化关系最近,其次是芹菜(图3)。

A:BrCCD4a保守域预测;B:不同物种CCD4基因编码的氨基酸序列比对。图中彩色表明共有的序列。黑色方框中的区域为RPE65结构域。

标尺上的数字表示遗传距离。

理化性质分析结果显示,不结球白菜BrCCD4a蛋白的相对分子质量为65 860,等电点为6.42(表1)。不同物种CCD4氨基酸残基数为582～613,相对分子质量为63 750～66 990,等电点为5.64～7.19。CCD4总平均疏水性系数均为负值,显示不结球白菜BrCCD4a为亲水性蛋白。

表1 不结球白菜与其他植物CCD4蛋白氨基酸组成成分及理化性质分析

2.2 BrCCD4a蛋白的二级结构与三级结构

不结球白菜的BrCCD4a蛋白二级结构预测结果显示,BrCCD4a蛋白的二级结构组成中无规则卷曲的占比最多,达55.52%。其次是延伸链,占23.08%,α-螺旋和β-转角比例较少,分别占14.55%和6.86%(图4A)。BrCCD4a的三级结构预测结果显示,以相似度较高的玉米VP14(ID:3npe.1)三级结构为模板,其序列一致性为40%,GMQE 值为0.69,覆盖率达85%,覆盖区域在第80～598位(图4B)。

A图中蓝色、红色、绿色和紫色分别表示α螺旋、延伸链、β转角和无规则卷曲。

信号肽预测结果表明BrCCD4a蛋白不存在信号肽。

2.3 BrCCD4a的亚细胞定位

观察农杆菌瞬时表达后的烟草叶片荧光,发现BrCCD4a-EGFP的绿色荧光信号位于叶绿体,并与叶绿体自发的红色荧光重叠,表明BrCCD4a-EGFP定位在叶绿体上(图5)。

图5 BrCCD4a在烟草叶片中的亚细胞定位

2.4 不同颜色不结球白菜叶片类胡萝卜素含量

不结球白菜叶片中叶黄素和β-胡萝卜素含量较高,但不同品种间差异显著(图6)。HB02叶片中叶黄素含量和β-胡萝卜素含量均最低,分别为1.14 mg/g和1.19 mg/g。SX04叶片中叶黄素含量最高,为HB02叶片中含量的2.05倍,达2.34 mg/g。NN2108和SX04叶片中β-胡萝卜素含量没有显著差异,但两者均显著高于HB02,分别为HB02的1.94倍和1.92倍。

不同字母表示品种间类胡萝卜素含量存在显著差异(P<0.05)。

2.5 不同颜色不结球白菜叶片中BrCCD4a的转录水平

相对表达量分析结果表明,不同颜色不结球白菜叶片中BrCCD4a基因转录水平存在显著差异(图7)。BrCCD4a在NN2108叶片中表达量最高,其次是SX04,在HB02叶片中表达水平最低。在NN2108叶片中的转录水平是SX04叶片中的1.70倍,是HB02叶片中的5.53倍。

图7 BrCCD4a在不同颜色不结球白菜叶片中的转录水平

3 讨论

类胡萝卜素代谢调控一直是园艺植物研究的热点。越来越多的研究结果表明,CCD4在植物的类胡萝卜素和香气等物质代谢中发挥着重要作用[17]。本研究从不结球白菜NN2108中克隆获得BrCCD4a基因,发现不同物种间CCD4蛋白的氨基酸序列和理化性质存在差异,氨基酸残基数集中在600个左右。二级结构预测发现不结球白菜BrCCD4a蛋白β-转角的比例最低,无规则卷曲占比最高,表明该蛋白质结构高度保守,这与梨CCD4蛋白的特征一致[18]。系统进化结果表明,BrCCD4a与同科植物甘蓝亲缘更近,亚细胞定位结果显示BrCCD4a蛋白定位在叶绿体。张志硕[19]对7个不结球白菜品种的品质进行测定,发现苏州青叶片中的类胡萝卜素含量显著高于其他品种。本研究中,SX04属于苏州青类型白菜,其叶黄素和β-胡萝卜素含量也相对较高。

CCD4酶具有不同的存在形式,各亚型不仅具有不同的表达模式,对底物的亲和力也不同,β-胡萝卜素通常被认为是CCD4的首选底物,此外其对叶黄素尤其是玉米黄质的亲和性也较强[4]。Watanabe等[20]利用CRISPR/Cas9体系敲除白色牵牛中的InCCD4基因,发现阳性植株花瓣变为淡黄色;Song等[21]在水稻中过表达拟南芥AtCCD4基因,发现β-胡萝卜素含量和叶黄素含量显著降低,而β-紫罗酮含量增加了2倍; Li等[22]发现白色胡萝卜中DcCCD4的表达水平明显高于橙色胡萝卜,证实该基因是通过裂解肉质根中的α-胡萝卜素和β-胡萝卜素而影响类胡萝卜素的积累;周伟权[23]也发现杏果实中CCD4基因表达水平与类胡萝卜素含量呈负相关。本研究中BrCCD4a在紫色不结球白菜品种NN2108中表达水平最高,其叶黄素含量低于深绿色品种SX04,这与前人研究一致。深绿色品种SX04叶片中类胡萝卜素含量最高,其颜色最深可能是由于其他叶绿体色素积累所致。浅绿色品种HB02中BrCCD4a表达量最低,但叶黄素和β-胡萝卜素含量也最低,可能是因为不同品种中的CCD4亚型差异引起降解能力不同,也可能是品种差异性导致,这有待进一步分析。

CCD蛋白家族成员众多,各亚家族成员之间结构差异较大,在植物生长发育与果实形成等过程中发挥着广泛的作用[24]。CCD4在万寿菊[25]、牵牛[20]、桂花[11]等植物花色调控方面的作用研究较多,在桃[7]、番木瓜[26]和柑橘[9]等果实色泽调控中的作用也有较多报道,但在不结球白菜中的相关研究还较为匮乏。针对性状形成的分子机制研究对定向育种具有重大意义,本研究从分子水平对不结球白菜CCD亚家族关键基因BrCCD4a进行了较为系统的分析,初步探讨其在不结球白菜类胡萝卜素代谢中的作用,为进一步探究CCD4基因在不结球白菜叶片色泽形成中的调控机理提供基础。