BRAF融合在非小细胞肺癌中的研究进展

肖平 钟殿胜

肺癌是世界上发病率和死亡率居高不下的恶性肿瘤，其中非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）约占85%[1]。随着靶向药物、免疫检查点抑制剂（immune checkpoint inhibitors, ICIs）的飞速进步，肺癌的治疗格局发生了重大改变。与传统的化疗相比，靶向药物、ICIs治疗明显延长了无进展生存期（progression-free survival, PFS）和总生存期（overall survival, OS）。因此，寻求有效的靶点成为肺癌治疗的重要决策。

鼠类肉瘤病毒癌基因同源物B1（V-Raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1,BRAF）在晚期NSCLC中的突变率为2%-6%[2-4]。BRAF突变患者预后差，生存期较短，靶向药物的出现为这类患者带来了希望。目前指南推荐达拉非尼联合曲美替尼作为BRAFV600突变的晚期或转移性NSCLC患者的首选治疗[5,6]。

BRAF除了突变之外，还可以发生断裂重排，形成新的融合基因。BRAF融合最早在2005年在甲状腺癌中被报道[7]，开启了BRAF融合在肿瘤治疗的探索。目前研究最多的是毛细胞星形细胞瘤，大约60%的毛细胞星形细胞瘤会出现BRAF融合[8]。随着基因检测的应用，尤其是第二代测序技术的深入，越来越多BRAF融合在其他癌种中被发现。2017年斯隆-凯特林癌症研究所（Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, MSKCC）应用MSK-IMPACT检测方法，对10,000例晚期实体瘤患者进行第二代测序，发现BRAF融合39例，其中NSCLC检出率为0.38%，结肠癌为0.2%，乳腺癌为0.08%，胰腺癌为1.43%，前列腺癌为0.8%，胆囊癌为0.41%，卵巢癌为0.46%，胶质瘤为0.78%，生殖细胞肿瘤为0.37%，软组织肿瘤为0.46%[9]。融合基因可能是致癌的驱动因素，也是靶向治疗的潜在目标。在NSCLC患者中，尤其表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor,EGFR）靶向药物耐药后的患者，BRAF融合的检出逐渐增多，然而BRAF融合的治疗仍参照非驱动基因突变的患者，缺乏有效的治疗策略，因此加强对BRAF融合的认识并探索更加有针对性的治疗方案势在必行。本文就BRAF融合在NSCLC患者中的临床特点、作用机制、临床治疗等方面进行综述，为BRAF融合的治疗提供更多的选择。

1 BRAF基因的生物学特征

BRAF是一种原癌基因，定位于7号染色体，包含18个外显子，编码BRAF蛋白。从N端到C端依次是高度保守区（conserved regions, CR）1、CR2和CR3三个CR，其中CR1区由RAS蛋白结合区和富含半胱氨酸区组成，可以与RAS-三磷酸鸟苷（guanosine triphosphate, GTP）结合；CR2区富含丝氨酸/苏氨酸，调节磷酸化RAF激酶活性；CR3区为三磷酸腺苷（adenosine triphosphate, ATP）结合位点和激活区，含有酪氨酸和丝氨酸残基及有多个磷酸化位点，磷酸化后可激活BRAF蛋白和诱导性激活细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase, ERK）[10]。

BRAF作为RAS-RAF-MEK-ERK通路的上游调节因子，参与丝裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase, MAPK）通路的活化。当细胞外生长因子与细胞表面的受体结合后，活化膜结合蛋白RAS，活化的RAS蛋白使BRAF二聚化，并磷酸化激活MAPK激酶（MAPK kinase,MEK）进一步激活ERK，促进肿瘤细胞的增殖、分化、迁移。

依据是否具有激酶活性、对RAS活化的依赖性和RAF的二聚化特征，BRAF突变可分为I、II、III类[11]。其中，I类突变为具有高激酶活性单体突变，不依赖RAS活性，且不需要二聚体来激活下游ERK通路，激活的ERK对RAS蛋白产生负调控，导致RAS活性降低。I类突变主要发生于CR3（BRAF激酶结构域）的外显子11和15，以BRAFV600突变为代表。II类突变为具有激酶活性的二聚体且不依赖RAS活化。这类突变使活化区与p-LOOP交互作用解除，解除激酶的自身抑制状态。III类突变依赖RAS活化，通过野生型CRAF的二聚作用，激活信号，为无激酶活性的异源二聚体，具有高RAS-GTP活化水平[12]。

2 BRAF融合NSCLC临床特点

在一项大样本NSCLC患者研究[13]中，应用Foundation Medicine CGP检测17,128例患者的石蜡标本，发现42例BRAF融合，BRAF融合仅占0.2%，非常罕见。BRAF融合主要发生在肺腺癌患者中，中位年龄为67岁（范围：44-93岁），55%为女性患者，48%在原发灶检出，52%在转移灶检出。与BRAF融合基因共存的常见驱动基因包括TP53（67%）、CDK N2A（31%）、EGFR（29%）和CDK N2B（26%）[13]。BR A F融合患者的肿瘤突变负荷（t umor mutational burden, TMB）较低，中位数为3.8 mut/Mb，其中7%（3/42）的患者TMB>20 mut/Mb，35%（15/42）的患者TMB在6.1-19.9 mut/Mb，57%（24/42）的患者TMB在0-6 mut/Mb[13]。

在EGFR突变患者中，应用EGFR-酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitors, TKIs）耐药后，BRAF融合检出率为1%-2%[14-16]。BRAF融合的出现导致细胞MEK、ERK通路的磷酸化增加，下游MAPK信号通路组成性激活，进而影响肿瘤细胞对抗EGFR靶向治疗的敏感性，揭示BRAF融合为EGFR-TKIs获得性耐药的一种机制。Peng等[17]在中国EFGR突变人群中，发现EGFR-TKIs治疗耐药后合并BRAF融合的17例患者中有12例为EGFR19del，提示BRAF融合在EGFR19del的患者中更易出现（P=0.015）。此外，在BRAFV600E突变的黑色素瘤中，BRAF抑制剂联合MEK抑制剂治疗后，检出BRAF融合基因，表明BRAF融合可能为BRAF抑制剂获得性耐药的一种机制[18]。

3 BRAF融合作用机制

BR AFI类突变导致M APK持续活化，负反馈抑制RAS，阻止BRAF二聚化，保持单体构象。与导致激酶结构域突变的BRAF单体突变相反，BRAF融合蛋白保留正常的激酶结构域，BRAF基因融合导致N端CR1自动抑制区域断裂，无法有效抑制BRAF活化，导致BRAF基因形成二聚体而结构性持续活化，且不依赖上游RAS活性，功能类似于II类突变[15,19]。活化后的BRAF导致下游MAPK信号通路异常激活。BRAF融合蛋白表达未突变的激酶结构域，可能表现出多种构象状态，对小分子抑制剂（如Vemurafenib）的亲和力降低[20]。

4 BRAF融合伴侣

目前肺癌中发现众多BRAF融合伴侣，包括AGAP3、AGK、A R MC10、SA LL2、DOCK4、EPS515、GHR、KIAA1549、TRIM24、AP3B1、KCND2、GRM8、PARP12、BIN1、EYS、TRIO、PTPRN2、LMO7、PTPN13、UBN2、ZC3HAV1、ERC1、BTFL34、EPS15、MKRN1、NUP214、STAT3、ZC3HAV4等[13,21-23]，63%的融合体与BRAF位于同一条7号染色体上[24]，其中最常见的融合体为AGK、DOCK4和TRIM24。BRAF融合断点常位于已知的热点区域（外显子7-11）[17]，保留了BRAF二聚化基序和BRAF激活区。融合基因的表达依赖于融合伴侣启动子，融合伴侣通常具有二聚化或寡聚化序列，5’端的伴侣编码卷曲螺旋结构域，使激酶二聚化。然而BRAF具有自己的二聚化基序，跨越外显子12和13，在目前已知的BRAF融合体中BRAF二聚化基序是完整的，因此，BRAF融合功能可能不需要具有二聚化能力的5’伴侣[25]。

5 BRAF融合的治疗

对于BRAF融合，目前指南没有相关针对抗BRAF治疗的相关推荐。不过，其他癌症、临床前研究及个案报道对BRAF融合的治疗会有所启示（表1）。

表1 BRAF融合肺癌病例汇总Tab 1 Summary of case reports of BRAF fusion in NSCLC

5.1BRAF融合与靶向治疗

5.1.1 BRAF抑制剂单药 第一代RAF抑制剂（包括达拉菲尼和威罗菲尼）针对激活的BRAF蛋白，与ATP竞争结合位点，导致活性位点无法暴露。第一代RAF抑制剂优先抑制BRAF单体，因其与BRAF二聚体中的一个位点结合，显著降低其与第二个位点的亲和力，因此对具有激酶活性的二聚体是无效的。在BR AF融合细胞系中，应用第一代BRAF抑制剂后，导致BRAF融合蛋白的反常激活以及MEK磷酸化增加[26]，无法有效抑制肿瘤生长。多项临床前研究[15,18,27]显示第一代BR AF抑制剂不能克服由于BR AF融合导致的耐药。而正在临床研究阶段的新一代RAF抑制剂-RAF二聚体阻断剂（PLX8394、FORE8394等）以及泛-RAF（pan-RAF）抑制剂，通过抑制前聚体，避免BRAF反常激活，不仅可有效抑制BRAFV600单体突变，同时能对BRAFII/III类突变以及BRAF融合有效[26]，这类药物未来可能对BRAF融合突变的治疗带来新的改变。

5.1.2 MEK抑制剂单药 曲美替尼是MEK1和MEK2激酶的可逆性抑制剂，通过对MEK蛋白的抑制作用，影响MAPK信号通路，抑制细胞增殖。对于BRAFV600突变的患者，曲美替尼联合BRAF抑制剂具有协同抗肿瘤的作用。在BRAF融合的患者中，多项临床前研究及个案报道发现曲美替尼对BRAF融合有效。Wang等[28]报告1例原发LIMD1-BRAF融合的肺腺癌，患者拒绝化疗，一线应用曲美替尼抗肿瘤治疗，PFS达7.4个月。另外1例晚期肺腺癌，初始检测出SND1-BRAF融合，经过化疗、抗血管、免疫等多线治疗后，检测出SND1-BRAF以及BRAF-RNF150融合，给予曲美替尼治疗后，症状明显缓解，病情评估为部分缓解[29]。在其他癌症中，如黑色素瘤[18]、前列腺癌[30]、胶质瘤[31]等，曲美替尼对于BRAF融合的患者治疗有效也有报道。因此，对于BRAF融合的患者可考虑采用曲美替尼进行治疗。

5.1.3 多激酶抑制剂 多激酶抑制剂包括索拉菲尼、瑞戈非尼、培唑帕尼等，这类药物为非特异性BRAF抑制剂，与BRAF非激酶活性构象相结合，针对的是未活化的BRAF蛋白，通过结合到BRAF蛋白的“口袋”上，导致ATP分子无法进入，抑制肿瘤细胞的生长，对包括BRAF在内的多种激酶均有抑制作用。在黑色素瘤、前列腺癌细胞系中，索拉菲尼可以抑制BRAF融合细胞生长[32,33]。不过这类药物单用抗肿瘤作用有限，在BRAF融合的恶性黑色素细胞瘤和恶性梭形细胞瘤中，有索拉菲尼联合治疗有效的个案报告[34,35]。

5.1.4 RAF抑制剂联合MEK抑制剂 目前在BRAF融合黑色素瘤异种模型中，pan-RAF抑制剂联合MEK抑制剂具有协同抗肿瘤的作用[24]。对于奥希替尼耐药的患者，临床前研究[36]表明，EGFR-MEK途径的双重抑制优于单独抑制MEK信号通路。在个案报道中，BRAF抑制剂联合MEK抑制剂对于BRAF融合的患者疗效显著。Chou等[37]报告1例分化差的晚期肺腺癌患者，一线接受化疗联合帕博丽珠单抗，疾病进展后基因检测同时检出KIAA1549-BRAF融合和MET扩增，后续给予卡博替尼、达拉非尼和曲美替尼治疗有效，疾病控制超过6个月。另外1例EGFR19del患者，一线厄洛替尼治疗耐药后，检出T790M突变，二线奥希替尼治疗，耐药后检出MKRN1-BRAF融合，三线化疗联合奥希替尼治疗疾病进展，四线予奥希替尼联合曲美替尼、达拉非尼，疾病得到控制[38]，但是需要关注联合治疗导致的不良反应。

5.1.5 MEK/PI3K抑制剂或MEK/CDK4/6抑制剂联合 在恶性肿瘤中，大多会出现MAPK、细胞周期以及磷脂酰肌醇3-激酶-哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（phosphatidylinositol 3-kinase-mammalian target of rapamycin, PI3K-mTOR）信号通路改变，联合抑制这些信号通路可能对抗肿瘤起到协同作用。在黑色素瘤BRAF融合细胞系中，与单用MEK抑制剂相比，应用MEK抑制剂联合PI3K抑制剂或MEK抑制剂联合CDK4/6抑制剂具有协同抗肿瘤作用[39]。这些联合治疗也是未来探索的一个方向。

5.2BRAF融合与免疫治疗 驱动基因阳性的患者，ICIs的疗效差强人意。对于BRAF突变的患者具有较高的TMB和程序性死亡配体1（programmed cell death ligand 1, PD-L1）表达水平，可潜在从ICIs治疗中获益。研究[40]发现BRAF突变的患者单药ICIs的客观缓解率（objective response rate,ORR）为10%-30%，中位PFS为2-4个月，与驱动基因野生型NSCLC二线治疗中的疗效类似，并且对于BR AF非600E突变的患者，免疫治疗的疗效更好一些。不过对于功能类似于II类突变BRAF融合的患者，总体TMB较低（中位数为3.8 mut/Mb）[13]，免疫获益可能性较小。在黑色素细胞瘤中，Panning等[41]报告5例BRAF融合/重排的患者，应用ICIs治疗后，4例出现疾病进展，提示免疫治疗疗效不佳。在NSCLC中，BRAF融合免疫治疗效果尚不明确，目前仅在个案报道中有少量报道。Yu等[29]报告1例初始存在BRAF融合合并PD-L1（应用22C3抗体）肿瘤细胞阳性比例分数（tumor proportion score, TPS）为30%的肺腺癌患者，一线化疗联合抗血管进展后，免疫单药以及联合化疗治疗效果不佳，后续给予曲美替尼治疗后达部分缓解。另外Kong等[42]报告1例肺腺癌患者接受EGFR靶向药物耐药后，检出BTN2A1-BRAF融合，并且PD-L1高表达（TPS为90%，应用22C3抗体），然而给予度伐利尤单抗单药治疗无效。

在结肠癌中，BRAFV600E突变与CpG岛甲基化表型相关，导致MLH1启动子过度甲基化，微卫星高度不稳定。而基因融合同样可导致MAPK信号通路活化，MLH1基因启动子CpG岛发生甲基化，使得细胞发生微卫星不稳定，患者可能从免疫治疗获益[43]。在一项回顾性研究[43]中，2314例结肠癌患者发现21例存在基因融合（包括8例NTRK、2例FGFR、1例ROS1、1例ALK、4例RET、5例BRAF等），其中57%（12/21）为微卫星高度不稳定状态，并且这些患者均存在MLH1表达缺失。Heinrich等[44]报告在1例胰腺癌患者，存在TRIM24-BRAF融合，同时患者存在MLH1启动子超甲基化，微卫星高度不稳定状态，一线给予帕博丽珠单抗治疗后，肿瘤达到持久的控制。因此，对于BRAF融合的患者，可以考虑行DNA错配修复系统/微卫星不稳定状态检测。

6 未来挑战与方向

BRAF融合的患者比例低，治疗手段有限，很难开展前瞻性临床研究。目前其治疗策略仍类似于驱动基因阴性的患者。基于检测方法的局限性、检测标本的差异以及实验室条件的不同，很可能低估了激酶融合导致的肿瘤患者人数。未来可以考虑因地制宜选择合适的检测方式，以最大限度地为患者提供精准治疗。基于以上临床前研究以及个案报道，对于BRAF融合的患者仍需要进行更多的探索。免疫治疗差强人意，MEK抑制剂、新型RAF抑制剂以及联合治疗模式显示出明显的抗肿瘤效果，未来需要进一步进行多中心的临床研究或“篮子”试验，为BRAF融合治疗提供更可靠的理论依据。此外，在ALK基因融合中，不同的融合位点及融合方式对靶向药物的敏感性及耐药方式不同，但是关于BRAF不同的融合伴侣是否影响药物的敏感性和继发性耐药目前尚不清楚，以及不同癌种对治疗的敏感性是否存在差异，这也是未来需要进一步进行探索的方向。因此，BRAF融合有望成为NSCLC潜在的治疗靶点，为肺癌的个体化治疗提供新的方向。