Hippo信号通路成骨、成肌分化功能研究进展

陈博 邓强 李中锋 彭冉东 王雨榕 刘晏东

1. 甘肃中医药大学,甘肃 兰州 730000

2. 甘肃省中医院,甘肃 兰州 730000

Hippo信号通路是高度保守的通路,在调节组织内环境稳定、器官大小、干细胞自我更新或分化中起重要作用[1]。Hippo通路的辅因子YAP与TAZ通过介导转录增强相关结构域转录因子(TEAD)家族转录,从而调节多种基因的表达,促进组织生长和细胞生存[2]。肌少-骨质疏松症(osteo-sarcopenia,OS)是肌少症(sarcopenia,SP)和骨质疏松症(osteoporosis,OP)并存的退行性代谢综合征[3-4]。随着全球人口老龄化的加剧,OS的发病率逐年上升[5],严重影响人们的健康并为社会医疗带来巨大负担[6]。肌肉和骨骼均起源于间充质干细胞,组织发育具有同源性,OS可通过对间充质干细胞分化为成骨细胞和肌管的效应进而影响肌肉-骨骼系统。

在骨代谢中,由成骨细胞介导的骨形成和破骨细胞介导的骨吸收之间的动态平衡对建立理想的骨重建具有重要意义,而成骨细胞分化又是骨稳态和修复的关键过程。骨骼肌的再生修复依赖于卫星细胞,卫星细胞增殖为成肌细胞,成肌细胞可分化为多核肌管,从而促进肌肉的生长[7]。以往的研究证明,BMSCs和BMPs以及骨骼肌卫星细胞和成肌细胞可在Hippo通路的诱导下进行成骨、成肌分化[8-12]。本文就Hippo信号通路在成骨、成肌分化功能中的作用和机制的近期研究进展进行综述。

1 Hippo信号通路概述

哺乳动物Hippo信号传导成分包括肿瘤抑制剂哺乳动物STE20样蛋白激酶1(MST1,也称为STK4)和MST2(也称为STK3),它们与果蝇中的Hpo直向同源;支架蛋白Salvador同源物1(SAV1,与果蝇中的Salvador直向同源);肿瘤抑制因子同源物1(LATS1)和LATS2(其与果蝇中的核Dbf2相关家族蛋白激酶Warts直向同源);以及支架蛋白MOB结构域激酶激活物1A(MOB1A)和MOB1B。MST1、MST2和SAV1形成复合物磷酸化并激活LATS1和LATS2激酶,LATS1和LATS2激酶与辅因子MOB1相互作用,MOB1进一步磷酸化转录辅激活因子YAP和TAZ。Hippo信号转导的激活通过阻止YAP和TAZ易位到细胞核中并促进它们在细胞质中的降解来抑制YAP和TAZ的转录活性。在不存在Hippo信号转导的抑制的情况下,YAP和TAZ可以在核中与不同的转录因子如TEA结构域转录因子家族成员(TEAD)配对,以调节靶基因的转录,如编码调节细胞增殖和存活的蛋白质的基因[13]。

虽然YAP和TAZ最常与TEAD相互作用,但这些共激活因子也显示出与其他转录因子相互作用的能力,其中包括CCAAT/增强子结合蛋白-α(C/EBPα)、cAMP反应元件结合蛋白(CREB)、早期生长反应蛋白1(EGR1)、受体酪氨酸蛋白激酶erbB4(ERBB4)、成肌细胞决定蛋白1(MYOD1)等。此外,一些因子抑制YAP和/或TAZ作为核转录辅因子的活性,如支架蛋白血管动蛋白样蛋白1(AMOTL1)可与YAP和原钙粘蛋白Fat4物理相互作用以形成将YAP隔离在细胞质中的复合物[14],转录辅因子退化样蛋白4(VGLL4)直接与YAP竞争TEAD在核中的结合[15],肿瘤抑制剂因子NF2(神经纤维蛋白2)也主要通过激活Hippo激酶活性而起到YAP抑制剂的作用[16]。

2 Hippo信号通路促成骨分化的研究进展

2.1 Hippo通路调控BMSCs影响骨生成

Hippo-YAP信号轴对BMSCs的成骨分化有着显著的影响[17]。通常骨髓衍生的BMSCs、破骨细胞和成骨细胞参与骨代谢。近年来,一些研究报道骨质疏松症主要归因于BMSCs的成骨分化降低[18]。作为成骨细胞的前体[19],刺激BMSCs增殖并分化成成骨细胞,从而提高骨生成的作用是至关重要的。

2.1.1αCGRP通过Hippo-YAP途径调控BMSCs影响骨生成:G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptors,GPCR)是膜受体的一个大家族,被鉴定为Hippo途径和YAP与TAZ的调节剂[20]。降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide,CGRP,一种37个氨基酸的肽)是在骨代谢、心血管系统、胃肠系统和疼痛的调节中表达的重要神经肽[21],相关研究已经证明CGRP能够在体外刺激BMSCs分化成成骨细胞[22-23]。CGRP有两种形式:αCGRP和βCGRP。传统上认为αCGRP是骨形成的生理激活剂,而βCGRP对此过程几乎没有影响[24]。研究表明,αCGRP-/-小鼠的骨形成和骨量减少下调[25],进一步实验发现,通过体内慢病毒转染,αCGRP在钛种植体周围的骨发育、代谢和重塑中发挥重要的病理生理作用。

Fei等[26]指出CGRP诱导的小鼠BMSCs的骨生成与Hippo途径有关。Hippo-YAP信号传导是GPCR的下游分支,由于CGRP受体属于GPCR,并且观察到受体组分之一的降钙素受体样受体 (calcitonin receptor-like receptor, CLR)可以阻止YAP磷酸化[27],因此αCGRP通过Hippo-YAP途径调控BMSCs影响骨生成。Yu等[28]也在他们的研究中发现,CLR是Hippo信号通路受体的一种成分,其可以阻止YAP磷酸化。因此,CLR可能促进骨代谢过程中的YAP功能。

Wang等[8]应用αCGRP慢病毒稳定转染BMSCs,并进行转染鉴定和细胞周期检测,在野生型和αCGRP-/-小鼠的BMSCs中研究了αCGRP对成骨分化的影响,结果显示BMSCs的生物学功能包括迁移能力和成骨能力与其αCGRP的表达呈正相关。这项研究显示,成骨细胞相关标志物表达水平的增加与Hippo通路的关键下游效应器YAP的表达增强有关。

因此,αCGRP在骨重建的内在机制中发挥着重要作用,并且提示αCGRP能促进骨生成。然而,其内在机制尚不清楚,是否涉及其他信号通路也一直是个谜。

2.1.2RAMP1通过Hippo-YAP途径调控BMSCs影响骨生成:受体活性修饰蛋白1(receptor activity-modifying protein-1,RAMP1,一种含有148个氨基酸的蛋白质)是一种单通道跨膜分子,具有一个大的胞外氨基末端和一个短的胞内羧基尾[29]。它主要的生物学作用是通过与细胞表面的CLR结合, 协助CLR向细胞膜的转运, 并形成CGRP的特异性受体,并且可以增强GPCR功能的多样性[30]。通常,功能性CGRP受体由至少3种蛋白质组成:CLR、RAMP1和RCP[31]。此外,这些蛋白质还在调节受体运输、信号传导和细胞的生物学特性如增殖、迁移和分化中具有广泛的作用[32]。

RAMP1可能是骨伤口愈合过程中的关键调节因子。Lee等[33]在BMSCs中使用RAMP1过表达慢病毒系统,碱性磷酸酶(ALP)活性测定和茜素红染色显示,在CGRP处理后,RAMP1促进了BMSCs的成骨分化。此外,实时聚合酶链反应和蛋白质印迹分析表明,RAMP1上调成骨表型标志物(ALP、矮小相关转录因子2、骨桥蛋白;P<0.05)。为了进一步揭示RAMP1在成骨分化中的机制,他们使用维替泊芬阻断YAP1,结果显示维替泊芬损害RAMP1诱导的骨生成。

有研究认为可以通过操纵RAMP1来调节CGRP功能。Bohn等[34]报告称,全面表达人RAMP1的转基因小鼠在各种组织中的CGRP信号传导增加,以往的研究也证实了RAMP1亚基因转移到血管平滑肌细胞中增加了CGRP功效。以往的研究表明RAMP1广泛分布于成熟的成骨细胞中。最近的研究报告称,RAMP1的过表达增强了镁诱导的大鼠骨折愈合骨形成[35]。此外,Zhang等[36]证实,RAMP1过表达可促进外源性CGRP增强MG-63细胞的成骨分化。这些数据表明,RAMP1可能是骨生成过程中调节CGRP介导效应的潜在治疗靶点。

前期研究结果证实RAMP1是骨再生的关键介质,并表明RAMP1通过调节Hippo-YAP通路促进CGRP诱导的BMSCs成骨分化,然而,RAMP1在成骨中的作用及机制尚不明确,未来仍需进一步研究。

2.2 Hippo通路调控BMPs影响骨生成

骨形态发生蛋白(bone morphogenetic proteins,BMPs)是一种多功能的生长因子,在软骨成熟和骨形成过程中起着重要作用[37]。BMP信号通路通过经典的Smad和非经典的p38促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)途径从质膜受体转导到细胞核,其传导受多种内源性和外源性分子机制在不同空间水平上以正向和负向方式调节[38]。研究表明YAP通过调控BMP信号通路诱导成骨细胞分化[39]。

以往的研究提出Hippo通路转录辅激活因子YAP和TAZ维持骨祖细胞的干细胞特性并抑制成骨细胞的终末分化,而其他研究提出它们增强成骨细胞的分化和骨形成。Brandao等[10]使用斑马鱼尾鳍再生作为模型,发现Hippo-YAP通路是通过细胞非自主方式引导成骨细胞正确分化的基础。结果表明,间充质细胞中YAP活性通过旁分泌机制诱导成骨细胞中BMP信号的激活,从而指示成骨细胞分化的启动。一方面,YAP可能与BMP信号一起通过调节dkk1a(Wnt信号传导的负调节因子)的表达来抑制Wnt信号向近端胚基的扩展,从而限制骨祖细胞向远端胚基的扩展。另一方面,更重要的是YAP促进了近端区域间充质细胞中BMP2A(BMP信号传导配体)的产生,这对于邻近成骨细胞中BMP信号的激活以及成骨细胞的分化至关重要。

综上所述,Brandao等[10]的研究提供了一种新的通过Hippo-YAP途径形成骨的机制:将YAP整合到控制骨祖细胞维持和随后分化的信号级联中。证明了YAP抑制导致骨祖细胞的积累并以细胞非自主方式阻止成骨细胞分化,这种效应与成骨细胞中BMP信号传导的严重损害相关,可能是通过抑制周围间充质细胞中配体BMP2A的表达。

3 Hippo信号通路促成肌分化的研究进展

骨骼肌包含一组指定的成体干细胞,称为卫星细胞,卫星细胞的包含可能有助于增加肌肉质量,而肌纤维损失导致肌肉质量减少[40]。研究发现YAP和TAZ在人及小鼠的骨骼肌卫星细胞和成肌细胞中均有表达[11]。Hippo通路下游效应因子YAP和TAZ在骨骼肌卫星细胞和成肌细胞的增殖和再生中起关键作用,尤其是通过TEAD转录因子调节基因表达。转录辅因子YAP(YAP1)和TAZ(Wwtr1)主要通过结合TEAD1-4转录因子来调节基因表达。YAP和TAZ被Lats1/2磷酸化的多个HXRSS基序所抑制,从而促进细胞质的定位、14-3-3蛋白结合和降解。YAP S127A和TAZ S89A是关键的磷酸化位点,YAP S127A和TAZ S89A中Ser127或Ser89分别突变为丙氨酸阻止了这些残基的磷酸化并导致组成型活性。

YAP与TAZ的信号传导模块控制骨骼肌的肌生成。TEAD转录因子结合在心脏和骨骼肌基因的启动子和增强子中附近发现的CATTCC/GGAATG(MCAT或GTIIC基序)上[41],但TEAD1结合在横纹肌肉瘤中受抑制的肌肉基因上[42],这可能与YAP和TAZ也可抑制基因表达有关。卫星细胞负责出生后骨骼肌生长、肥大和修复再生[43],成肌细胞由肌卫星细胞分化而来,并且有研究已经表明YAP促进成肌细胞增殖[44]。YAP S127A在活化而非静止卫星细胞中的表达导致具有短潜伏期和100 %外显率的胚胎横纹肌肉瘤样肿瘤[45]。YAP S127A在肌纤维中的表达引起肌病[46],而其他类型的YAP递送或YAP突变体可引起肥大[47],结果可能取决于YAP水平。

3.1 效应蛋白YAP调控成肌细胞影响肌生成

YAP的mRNA和蛋白质表达在肌原细胞增殖期间高而在分化期间低[48]。此外,在C2C12细胞增殖期间,YAP Ser127磷酸化较低并且YAP定位于细胞核。分化后,YAP Ser127磷酸化增加约20倍,YAP从细胞核易位到胞质溶胶。在分化阶段,hYap1 S127A(一种不能在S127被Lats1/2磷酸化的YAP突变形式)的过表达诱导了两种分化基因肌生成蛋白和Mef2c表达的降低,以及成肌细胞增殖基因Myf5的持续表达。

Gnimassou等[49]开发了可诱导的骨骼肌纤维特异性敲入小鼠模型(MCK-tTA-hYAP1 S127A)以测试组成型活性YAP(hYAP1 S127A)的过表达是否足以刺激肌肉肥大或纤维类型组成的改变,发现这种突变形式的YAP的表达在约5周后引起了一种肌病和肌肉萎缩,接着是一个再生过程,包括卫星细胞的活化、增殖和分化。在分子水平上,卫星细胞活化和分化的标志物Myf5、肌细胞生成素和Pax7以及蛋白质降解的两种标志物Atrogin-1和MuRF-1在mRNA水平上高度表达。值得注意的是,当阻止YAP突变形式的表达时,纤维类型组成保持不变,萎缩和变性过程保持可逆。

然而,过表达总YAP而不是活性YAP可以通过与TEADs的相互作用诱导肥大,并且不依赖于mTOR的任何激活。Lin等[50]发现在肌原纤维成熟期间总YAP表达和S112磷酸化降低。此外,YAP表达的抑制引起肌原纤维大小的减小,并最终引起肌肉质量的减小。这种质量的减少与蛋白质降解标记Atrogin-1、Musa1和MuRF-1的表达略微增加相关。因此得出结论,YAP的表达对于维持和增加肌原纤维的大小是必需的。Gnimassou等[49]通过激动剂消除对跖肌施加显著的负担,发现YAP的更高表达以及TEADs进入跖肌的更高转录活性,由此突出YAP对肌肉上的机械负荷的敏感性。这种现象是伴随Akt磷酸化以与YAP表达相似的模式增加以及伴随注射雷帕霉素(PAPA)抑制mTOR后持续的肥大。Barker等[51]证实了YAP可以独立于mTOR诱导肥大。这种肥大可能至少部分是由于MuRF-1的低表达和MyoD和c-Myc的高表达。

综上所述,尽管一些研究表明YAP过表达或激活诱导肌肉萎缩,但其他人发现相反的结果,即YAP过表达后肥大。这些差异或许可以用诱导YAP表达的不同方式,病毒载体对基因突变和治疗的持续时间来解释。但也可能涉及其他未知因素,因此这个问题仍需进一步研究。

3.2 效应蛋白TAZ调控成肌细胞影响肌生成

Sun等[52]在体内和离体分析了TAZ,并与YAP进行了比较,小干扰RNA敲低或反转录病毒介导的野生型或组成型活性TAZ突变体在卫星细胞中的表达表明,TAZ促进增殖,这是与YAP共有的功能。

然而,在肌发生的后期阶段,TAZ促进成肌细胞的肌原性分化,而YAP抑制这种分化。在功能上,虽然TAZ(基因Wwtr1-/-)敲除小鼠的肌肉生长受到轻微影响,但对再生没有明显影响,相反,Pax7Cre-ERT2/1、YAPfl8x/fl8x和Rosa26Lacz小鼠产生再生缺陷。微阵列分析显示了许多常见的TAZ与YAP靶基因,但TAZ也独立于YAP调节一些基因,包括肌源性基因,如Pax7、Myf5和Myod1。蛋白质组学分析显示,TAZ与YAP在生肌细胞中有许多新的结合配偶体,但TAZ也与不同于YAP的蛋白质相互作用,这些蛋白质通常参与肌生成和细胞骨架组织方面。最后,TAZ通过TEAD 4发挥作用,增强肌源性分化。

总之,TAZ和YAP在促进成肌细胞增殖方面具有重叠功能,但TAZ在肌发生的后期阶段转换为增强肌原分化。

4 总结与展望

随着对Hippo信号通路以及YAP和TAZ的不断深入研究,Hippo途径在促进成骨、成肌分化功能中的作用也逐渐被证实,但其在作用过程中具体的发生机制以及作用中是否有其他信号通路的参与仍存在争议。并且进一步的研究发现,TGF-β、Wnt、Sonic-Hedgehog、Akt-mTOR等信号通路均可与Hippo信号通路发生交互作用[49]。

因此,未来应进一步深入研究Hippo信号通路在调控成骨、成肌发生的细胞机制以及YAP与TAZ如何与其他信号通路的关键因子相互作用。Hippo通路在细胞和器官水平上感知内源性和外源性信号以及调节生长的多个方面发挥关键作用[53],所以未来该通路将在临床诸多病症的靶向治疗上有着广阔的研究前景。当前,肌少-骨质疏松症已经成为全球性的公共健康问题和前沿研究难题[3],然而Hippo信号通路在其促进成骨、成肌分化功能中的作用展示了该通路未来治疗肌少-骨质疏松症的广阔前景和优势。故此,对Hippo信号通路在促进成骨、成肌分化过程中的相关作用机制和相关代谢的进一步研究,可为肌少-骨质疏松症临床治疗提供新的研究方向,为临床技术的推广带来新思路。总的来说,鉴于YAP和TAZ作为组织再生促进剂的巨大潜力,我们现在可以期待Hippo-YAP/TAZ信号传导的基础和转化研究,为医学的临床方法探索新的道路。