探讨“伏毒-细胞自噬-骨免疫”学说对骨质疏松症发病机制的影响

李平顺 田杰祥 周孟茹 魏勇 王钢*

1.甘肃中医药大学附属医院,甘肃 兰州 730000

2.甘肃中医药大学,甘肃 兰州 730000

骨质疏松症(osteoporosis,OP)是世界上最常见的骨病,其特征是骨矿物质密度低,使受影响的骨骼容易骨折。骨稳态取决于破骨细胞(osteoclasts,OC)的骨吸收与成骨细胞(osteoblast,OB)的骨形成之间的精确平衡,并涉及一系列复杂且高度调控的步骤。当骨吸收速度快于骨形成速度时,骨稳态就会被破坏。基于骨稳态的多种调节机制,临床上出现了一系列针对OP的药物,包括双膦酸盐、选择性雌激素受体调节剂、降钙素、分子靶向药物等。然而,许多药物有严重的不良反应或不适合长期使用。所以,基于OP的新发病机制,寻找更有效的治疗药物迫在眉睫。虽然OP 涉及多种分子机制,但疾病发作的两个关键因素是雌激素减少和氧化应激增加;有趣的是,雌激素似乎会诱导骨细胞发生自噬,而氧化应激是由自噬缺陷引起的。自噬是一种重要的细胞内稳态系统,可回收有缺陷的大分子和细胞器以维持细胞的新陈代谢。越来越多的证据表明,自噬是免疫细胞、骨细胞分化与活化的必需过程,自噬失调可导致骨免疫紊乱,直接或间接引起OB/OC比例失衡,骨组织微结构破坏,骨骼质量与强度降低。本综述以“伏毒”理论为切入点,以“伏毒-细胞自噬-骨免疫”学说为基础,探讨自噬、骨免疫学与OP的关系,为OP发病机制和潜在治疗靶点提供了新的见解。

1 伏毒理论

“伏毒”首见于《脉经》“热病……伏毒伤肺中脾者死;热病……伏毒在肝腑足少阳者死”中热病的论述[1]。“伏者,匿藏也”;所谓“伏邪”指藏于体内而不立即发病的病邪。“毒,邪气蕴结不解之谓”,当邪气过盛则可蕴而成毒。

国医大师周仲瑛认为“伏毒”是指邪毒深伏潜匿,伏而不觉,发时始显;且毒愈深,气愈虚,虚愈甚,邪愈滞,正愈伤,故伏毒具有缠绵、蛰伏、暗耗、多变、难治等致病特点。伏毒的成因无外乎外、内两端。外感邪毒入侵人体后,若正气盛,则暂不发病;若正气虚,则邪毒得以深伏内藏。内伤“伏毒”则是内伤久病,脏腑亏虚、阴阳失调,则湿、寒、热、火等内生邪气及痰饮、瘀血等有形实邪,郁积不化,日久酝酿而成湿毒、热毒、火毒、瘀毒、痰毒等,皆属伏毒[2]。

OP归属于中医“骨萎”,老人多虚多瘀,而骨痿的基本病理特点恰恰是虚、瘀。因虚至瘀,瘀久致虚,虚、瘀相互作用,产生新的病理产物,导致“伏毒”的产生,即“虚瘀致毒”。“虚”,脏腑亏虚,骨骼失养;“瘀”,血液成凝滞状态,骨骼及周围组织中的细胞难以通过血液进行物质交换,骨骼微循环被破坏,骨代谢紊乱;“毒”,骨细胞肥大、萎缩,或变性、凋亡。“伏毒”作用于骨骼,表现为骨组织微结构破坏,骨骼质量与强度降低,形成骨痿[3]。

2 自噬的中医微观机制

自噬是一个集合术语,涵盖了一系列分解代谢途径,通过溶酶体降解和细胞质成分的循环,如蛋白质聚集物、受损或无用的细胞器以及入侵的病原体,调节细胞内稳态[4]。自噬的3种主要亚型是,微自噬(通过内溶酶体腔室的限制膜内陷直接获得胞质货物)、伴侣介导的自噬(伴侣介导的未折叠蛋白通过KFERQ 样多肽序列募集到溶酶体)和巨自噬(以双膜囊泡为特征,即自噬体,它在与溶酶体融合以进入裂解室之前完全吞噬目标物)[5-6]。

自噬是由一系列自噬相关基因(autophagy related genes,ATGs)调控的。自噬的过程可以分为4个步骤[7-10]:①诱导自噬:该过程中涉及Atg1/ulk1复合物;②自噬体的形成:III类PI3K-Atg14复合体、Atg9-Atg2-WIPI-1(Atg18)复合体和Atg5-Atg12-Atg16L1复合体参与了自噬体的膨胀和成熟,还需要LC3/ GABARAP(酵母中的Atg8)的脂化作用,这取决于ATG3、ATG4和ATG7;③自噬体与溶酶体的转运和融合:该过程需要Rab7、异位p-颗粒自噬蛋白5同源物(EPG5)、HOPS、pleckstrin同源结构域含蛋白家族成员1 (PLEKHM1) 12和可溶性NSF附着蛋白受体(SNAREs);④完成自噬:这需要通过水解酶降解自噬体货物,并通过转运体/permeases将降解产物释放到细胞质中,在那里它们可以被重新用于合成生物大分子或其他代谢途径。

正常情况下,自噬可通过清除老化或受损的细胞器起到维持细胞内环境稳定的作用,然而,当自噬过度被激活或抑制则可导致各种病理过程。自噬的过程可看作是机体对于正气与邪气的调控反应,是中医阴阳动态平衡的微观体现。在邪气侵袭初期,自噬对细胞起着保护作用,当自噬功能被抑制时,则易导致各种疾病的发生,而疾病发生后期,自噬被过度激活必然耗伤正气。各种疾病的发生发展皆与绝对的或相对的自噬不足和自噬过度相关,这与“正虚”和/或“邪实”导致机体阴阳失和而发病相类似[11]。

正气是指人的形体结构、精微物质及正常的功能活动、抗病能力和康复能力,以及人体对外界的适应能力、调控能力,有维护自身生理平衡与稳定的功能。正如《内经》中所言:“邪之所凑,其气必虚。”外感邪毒入侵人体后,若正气盛,则暂不发病;若正气虚,则内伤“伏毒”。以OP为例,“伏毒”作用于骨骼,引起骨细胞绝对的或相对的自噬不足和/或自噬过度,导致骨细胞肥大、萎缩,或变性、凋亡,骨组织微结构破坏,骨骼质量与强度降低,形成骨痿;从此种意义上讲,自噬的失调与伏毒的形成和致病密切相关。

3 自噬与骨免疫学

人们早就认识到免疫系统和骨骼系统密切相关,这种串扰,也称为骨免疫学,是骨骼健康所需的主要过程。例如,各种免疫调节细胞(T和B淋巴细胞、巨噬细胞、DC)与OC诱导的骨吸收有关;免疫细胞释放促炎细胞因子,例如IL-1β、IL-6、TNF-α和IL-17在OC-OB耦合中充当关键调节剂,以维持骨重塑的平衡[12]。

骨免疫学是通过许多细胞和分子过程实现的,最近发现自噬在其中起着不可或缺的作用[13]。随着对细胞自噬和骨免疫分子机制的更深刻理解,自噬系统和骨免疫之间的密切关系逐渐被揭示出来:自噬在自噬衔接蛋白的帮助下,通过模式识别受体(pattern recognition receptor,PRRs)触发一系列免疫反应,从而完成清除细胞内微生物的基本过程[14]。同时,自噬通过消除内源性炎症小体干扰细胞因子等免疫介质,以及通过调节抗原呈递细胞内稳态等形式进一步影响免疫反应,最终引起OC/OB比例失调,导致骨质流失或关节破坏[15]。

3.1 自噬参与T、B淋巴细胞的分化与活化

自噬对T淋巴细胞分化与活化的影响:此效果可通过控制先天免疫细胞来实现的,例如,自噬缺陷的巨噬细胞大量分泌IL-1α和 IL-1β,在IL-6和TGF-β的协同作用下诱导Th17型T淋巴细胞免疫反应[16]。ATG5缺陷小鼠的骨髓样细胞在感染结核分枝杆菌后具有更高水平的IL-17,使用结核分枝杆菌抗原在体外刺激ATG5缺陷小鼠肺细胞淋巴细胞也表现出类似的CD4+T淋巴细胞的IL-17表达增加的现象[17]。T淋巴细胞在自噬的帮助下维持其活化状态[18]:①自噬抵消了上调的CD95和CD95 L对TCR刺激产生的促凋亡作用;②自噬消除了T淋巴细胞中受损的线粒体并维持正常的氧化应激水平以抑制细胞凋亡;③自噬通过维持内质网钙通量的稳态参与T淋巴细胞活化。

自噬对B淋巴细胞及抗体免疫反应的影响:浆细胞是终末活化期的B淋巴细胞,是获得性体液免疫应答的主要效应细胞。存在于次级淋巴器官(如脾脏和淋巴结)中的B淋巴细胞在遇到抗原后会分化为寿命短的浆细胞。反复刺激T淋巴细胞可产生记忆性B淋巴细胞和长寿浆细胞,这些细胞可在特化的骨髓生态位中终生存活,维持基础抗体水平并保留针对特定抗原的免疫记忆,从而能够及时产生防止病原体和有毒物质的抗体。浆细胞是专门的抗体分泌细胞,其中合成、组装和分泌大量抗体。B淋巴细胞向浆细胞的分化是由细胞应激介导的内在重塑过程,与蛋白质组学可塑性有关,涉及细胞压力、代谢和细胞更新之间的复杂关系。抗体产生的调控涉及研究这种特殊分泌细胞中的蛋白质折叠和组装,以及分析骨髓长寿浆细胞及其周围环境的成分。自噬在浆细胞分化中起着至关重要的作用,它涉及内质网、分化和抗体产生之间的平衡。自噬是决定长寿浆细胞命运和机体长期免疫力的内在因素[19]。

3.2 自噬对免疫效应分子的调控

自噬调节炎症小体的激活:炎性体是一种胞质多蛋白复合物,属于一类新的炎症信号通路,炎性体控制各种炎症因子的成熟和分泌,例如IL-1β、IL-17和 IL-33等。胞质NLR家族的成员(如NLRP3和NLRP1)与自噬受体相互作用形成炎性体[20]。在野生型巨噬细胞中,TLR激动剂LPS不能诱导炎性体激活和IL-1β 的分泌;当自噬调控基因ATG16L1或ATG7被敲除或使用化学试剂抑制自噬,LPS依赖性炎性体被重新激活;这些发现表明自噬调节炎性体的激活,同时限制炎性细胞因子IL-1β和IL-17的产生[21]。

迄今为止,自噬抑制炎性体的机制尚不清楚。一种可能的分子机制是通过自噬直接降解炎性体,因为自噬下调ROS的产生,从而抑制炎性体。自噬相关基因缺陷,如ATG5、ATG7、ATG12和ATG16L1, 导致线粒体的异常积累和ROS的大量增加。ROS可被先天免疫细胞中的炎性小体识别,释放促炎因子,进而引起炎症。自噬可以减少线粒体聚集和线粒体和过氧化物酶体的明显渗漏,从而负向调节细胞内ROS。这些发现表明ROS激活的自噬可能是一种负反馈调节机制[22]。

自噬对细胞因子产生和释放的影响:研究发现自噬可直接影响某些细胞因子的转录、加工和分泌。值得一提的是,正常自噬通路的破坏会增加促炎细胞因子IL-1α、IL-1β和IL-17的分泌[23]。

3.3 骨免疫对骨重塑的调控

骨骼系统和免疫系统之间的串扰最初通过研究发现,免疫细胞来源的IL-1可以诱导OC的分化。研究发现源自适应性免疫系统的T辅助细胞通过产生RANKL在关节炎的炎症性骨丢失中发挥关键作用;Th17细胞来源的IL-17是促进OC生成的关键炎症因子;而Th2细胞来源的IL-4和IL-10被认为是OC的抑制剂。另一方面,Treg细胞以直接的细胞间接触依赖性方式抑制OC生成,主要因为Treg上的细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)细胞与OCPs上的 CD80和CD86结合,从而产生IL-4、IL-10和TGF-β;来自先天免疫系统的抗原呈递细胞,如巨噬细胞,不仅充当OC前体,还参与OC生成调控[24]。

4 自噬与OP

绝经后OP涉及多种分子机制,但疾病发作的两个关键因素是雌激素减少和氧化应激增加。有趣的是,雌激素似乎会诱导骨细胞发生自噬,而氧化应激是由自噬缺陷引起的。自噬以基础水平存在于所有细胞中,以维持稳态并促进细胞存活以响应细胞应激条件,例如营养剥夺和缺氧。自噬是免疫细胞激活/极化和OC分化的必需过程,可保护细胞免受氧化应激;自噬在成骨过程中的本质是参与OB的分化和矿化,特别是自噬体在细胞外钙转运中的作用[25]。此外,自噬还参与维持骨髓造血干细胞生态位。

4.1 氧化应激中自噬的调节

氧化应激在调节骨重塑过程的平衡中起着关键作用,包括对骨形成和骨吸收的影响。氧化应激诱导的活性氧(reactive oxygen species,ROS)可导致骨细胞和OB凋亡并抑制骨矿化和成骨,这与不平衡的OC形成相结合,导致骨质流失加剧和OP进展[26]。在生理水平上,ROS可以作为信号分子参与细胞过程,如分化、增殖、凋亡、自噬和氧化还原信号;相反,过量的ROS水平会导致脂质、蛋白质和DNA受损,最终导致细胞死亡。为了应对氧化应激,自噬由细胞损伤引起的ROS水平调节,并通过细胞保护机制支持细胞存活,减轻氧化应激造成的损伤。然而,ROS的过度积累也会通过自噬失调加剧细胞损伤,导致线粒体功能障碍和ROS水平升高[27]。

4.2 成骨细胞自噬

自噬在骨形成中起着重要作用,包括骨髓干细胞(bone marrow stem cell,BMSCs)分化成OB再到骨细胞、成骨、分化和骨基质的形成。BMSC分化需要能量,而自噬体降解产物可被线粒体氧化,为其分化提供合适的能量供应[28]。BMSC向OB的分化过程涉及AMP活化蛋白激酶(AMPK)/mTOR信号轴介导的自噬的早期阶段以及Akt/mTOR信号轴激活的后期阶段[29]。相反,自噬水平的降低会直接抑制内源性BMSCs的功能,进一步促进OP的发展[30]。当BMSCs完全分化为OB时,基础自噬被完全抑制,但这并不表示分化的细胞不再具有自噬能力[31]。体外研究发现,OB中FIP200消融诱导的自噬缺陷导致OB分化功能障碍[32]。此外,下调自噬标志物(如LC3-II和ATG7)的表达已被证明会导致OB分化受到抑制[33]。

此外,自噬还直接参与OB的矿化过程。OB中ATG7的条件性敲低导致体内矿化能力降低[34],Osterix-Cre转基因小鼠中自噬相关基因Fip200或Atg5的敲除也导致小鼠矿化受损和骨量减少[35]。这些结果表明,在OB的矿化过程中需要自噬,这可归因于自噬泡作为将磷灰石晶体分泌到细胞外基质的载体。

4.3 破骨细胞自噬

OC从骨髓的造血干细胞分化而来,在骨重塑的开始阶段至关重要,随后分化成多核OC,然后迁移到骨骼表面。据报道,响应缺氧应激而产生的HIF1-α可上调BNIP3,从而增加Beclin-1的水平,然后激活伴随自噬相关基因ATG的自噬通量,从而通过上调CTSK、NFATC1和MMP9,进而刺激OC分化和生成[36]。此外,据报道,自噬起始蛋白Beclin-1的水平在OC分化过程中会增加。Ctsk细胞表达条件性Beclin-1缺陷小鼠通过减弱OC功能而表现出骨皮质厚度增加;而 Beclin-1在OC前体中的过度表达已被报道可增强体外自噬诱导的OC生成并增加骨吸收[37]。

除了在破骨细胞分化中的作用外,自噬还被证明对OC功能至关重要。终末分化的OC通过蒂紧密附着在骨表面,F-actin、talin、vinculin和α-actinin是OC附着的关键锚定目标,然后溶酶体迁移到骨表面并吸收骨。自噬相关蛋白 ATG4B、ATG5、ATG7和LC3都已被证明在促进骨吸收活动中起着至关重要的作用。例如,敲低OC中的ATG5和ATG7可显著减少骨陷阱的深度和体积,并降低将溶酶体递送至折叠膜边界的能力,尽管这似乎不会影响破骨细胞的形成[38]。

4.4 线粒体自噬

线粒体在ATP的产生中起关键作用,ATP为细胞提供90 %以上的能量。线粒体DNA完整性和修复能力在应激反应中受损,例如线粒体跨膜电位(mitochondrial transmembrane potential,MMP)增加、氧化应激和缺铁。如果损伤超过线粒体内膜的膜电位,功能失调的线粒体将通过自噬途径清除,这被称为线粒体自噬。线粒体自噬不仅通过清除由氧化应激引起的受损线粒体来保护细胞免于凋亡,而且还促进新线粒体的生物合成,这对细胞稳态至关重要。越来越多的证据表明,异常的线粒体自噬在干细胞分化和骨代谢紊乱中起着关键作用,进一步参与OP的发病,其机制可能与磷酸肌醇3-激酶(PI3K)和Pink1等信号有关[39]。

5 讨论

长期以来,自噬一直被认为是细胞分化的必要组成部分,在OC中,自噬效应与OC的分化、活性、功能呈正相关;在OB中,自噬效应与OB分化阶段有关:①BMSCs向OB分化阶段:细胞自噬可以促进OB分化;②成熟OB阶段:当BMSCs完全分化为OB时,基础自噬被完全抑制。自噬抑制可导致体外矿化受损和体内骨量/体积减少,随之诱导氧化应激和RANKL的产生,诱导OC分化,这些结果表明自噬在成骨细胞分化和矿化过程中的基本作用,它作为矿化载体,保护OB免受氧化应激增加。这与OB中自噬缺陷/抑制导致骨质疏松样表型并诱导OC分化的现象一致[40]。

当人体外感邪毒或内伤“伏毒”(类似于缺氧、遗传、激素和营养、年龄等因素),导致阴阳失衡(即产生氧化应激和自噬激活),T、B淋巴细胞分化及炎症因子分泌增加,诱导的ROS损害OB和骨细胞的骨形成并促进OC的骨吸收,OC自噬效应强于OB和骨细胞的保护作用,从而破坏骨稳态;而成熟OB的自噬被抑制,最终加速OP的进展。若致病因素导致自噬抑制,OB数量与功能下降,导致骨骼矿化受损和体内骨量/体积减少,随之诱导氧化应激和RANKL的产生,诱导OC分化,进一步诱发OP。

近年来随着对细胞自噬与骨免疫学的深入探索发现,以“伏毒”理论为切入点,以“伏毒-细胞自噬-骨免疫”学说为基础,探讨自噬是免疫细胞、骨细胞分化与活化的必需过程,自噬失调可导致骨免疫紊乱,直接或间接引起OB/OC比例失衡,骨组织微结构破坏,骨骼质量与强度降低,最终导致OP。

中药通过调控细胞自噬、骨免疫治疗OP具有广阔的研究前景,但“伏毒-细胞自噬-骨免疫”学说仍处于探索初期,其循证依据有待我们的进一步探究。未来将继续坚持在中医辨证论治原则下利用现代分子生物学、网络药理学及蛋白组学等相关技术,对“伏毒-细胞自噬-骨免疫”学说进一步深入研究,以期为OP的机制研究、诊断及治疗提供新思路。