妊娠期糖尿病患者血清circFOXP1和circMAP3K4基因表达变化及临床意义

肖波,方娟,张远远,王燕,吴利荣

妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus,GDM)是妊娠期间出现的代谢紊乱疾病[1]。GDM的危险因素包括肥胖、既往糖尿病史、2型糖尿病家族史和遗传等因素[2]。在妊娠晚期,血糖水平急剧升高[3]。但当前缺乏早期预测和诊断GDM的分子标志物,因此,研究GDM相关的生物指标,对提高GDM的诊断具有重要意义。在GDM患者血清中发现了大量失调的circRNA[4]。研究表明,环状RNA叉头框蛋白P1(circrna forkhead frame protein P1,circFOXP1)是一种转录抑制因子,在调节全身葡萄糖稳态中发挥作用[5]。糖尿病小鼠的肝脏circFOXP1表达水平降低[6]。circMAP3K4在GDM患者的胎盘中高表达,其表达与孕期母体体质量增加和口服葡萄糖耐量试验(oral glucose tole-rance test,OGTT)时间—血糖曲线的曲线下面积(AUC)呈正相关。生物信息学分析结果显示,circMAP3K4可以通过miR-6795-5p/PTPN1轴调节胰岛素-PI3K/Akt通路[7]。目前,对于circFOXP1和circMAP3K4基因表达在GDM患者的研究甚少,因此,本研究旨在研究GDM患者血清中circFOXP1和circMAP3K4基因表达状况,以期为GDM的诊断提供新的诊断标志物,报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2021年11月—2022年11月武汉科技大学附属汉阳医院妇产科收治GDM患者128例为GDM组,同期选择在医院孕检的健康孕妇128例为对照组,2组人员年龄、孕周、体质量指数(BMI)、产次、总胆固醇(TC)比较差异无统计学意义(P>0.05);与对照组比较,GDM组三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、空腹血糖(FPG)、空腹胰岛素(FINS)水平显著升高,高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平显著降低(P<0.01),见表1。本研究已经获得医院伦理委员会批准(2021001026),受试者及家属知情同意并签署知情同意书。

表1 对照组与GDM组孕妇临床资料比较

1.2 病例选择标准 (1)纳入标准:①符合《妊娠合并糖尿病诊治指南(2014版)》的诊断标准[8];②首次确诊为GDM者。(2)排除标准:①患有糖尿病、高血压的患者;②患有恶性肿瘤的患者；③免疫性疾病者;④精神异常无法进行正常交流的患者。

1.3 观测指标与方法

1.3.1 血脂血糖检测:孕妇入组当天抽取空腹肘静脉血10 ml,离心留取血清放置于-20℃待用。血清5 ml用于检测TC、TG、LDL-C、HDL-C、FPG、FINS水平。使用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测TC(上海酶研生物科技有限公司)、TG(上海化邦生物科技有限公司)、LDL-C(上海化邦生物科技有限公司)、HDL-C(上海恒斐生物科技有限公司)、FINS(上海西格生物科技有限公司)水平,采用葡萄糖氧化酶法测量血糖水平,试剂盒购自于北京索莱宝科技有限公司。

1.3.2 血清circFOXP1和circMAP3K4基因检测:上述剩余血清5 ml,采用实时荧光定量PCR(qPCR)检测血清circFOXP1和circMAP3K4基因表达,提取血清总RNA,使用反转录试剂盒(上海吉至生化科技有限公司)合成cDNA。使用荧光定量PCR仪(型号Rotor-Gene Q,QIAGEN)和qPCR试剂盒(江西艾博因生物科技有限公司)进行circFOXP1和circMAP3K4基因表达检测,反应体系共20 μl:2 × Probe qPCRFast Mix反应酶 10 μl,cDNA 1 μl,上下引物各1 μl,ddH2O 7 μl。反应条件:93℃ 90 s、93℃ 30 s、59℃ 30 s、72℃ 15 s,共计40个循环。试验重复3次,严格遵循试剂盒说明书进行。采用2-△△CT法分析结果。qPCR引物由南京擎科生物科技有限公司进行合成,引物序列见表2。

表2 血清circFOXP1和circMAP3K4引物序列

2 结 果

2.1 2组血清circFOXP1和circMAP3K4基因表达比较 与对照组比较,GDM组患者血清circFOXP1表达显著降低,circMAP3K4表达显著升高(P<0.05),见表3。

表3 对照组与GDM组血清circFOXP1和circMAP3K4基因表达水平比较

2.2 GDM患者血清circFOXP1与circMAP3K4表达的相关性 相关性分析显示,GDM患者血清circFOXP1和circMAP3K4表达呈负相关(r=-0.302,P=0.001)。

2.3 ROC曲线分析血清circFOXP1和circMAP3K4表达诊断GDM的价值 绘制血清circFOXP1和circMAP3K4表达诊断GDM的ROC曲线,并计算曲线下面积(AUC),结果显示,血清circFOXP1、circMAP3K4及二者联合诊断GDM发生的AUC分别为0.873、0.842、0.931,二者联合优于各自单独诊断(Z/P=2.207/<0.001,2.029/0.023),见表4、图1。

图1 血清circFOXP1和circMAP3K4对GDM诊断的ROC曲线

表4 血清circFOXP1和circMAP3K4诊断GDM的价值比较

2.4 Logistic回归分析影响GDM发生的危险因素 以GDM是否发生为因变量(发生=1,未发生=0),以上述结果中P<0.05项目(TG、LDL-C、HDL-C、FPG、FINS、circFOXP1、circMAP3K4水平)为自变量,进行多因素Logistic回归分析,结果显示,FPG高、circFOXP1低表达和circMAP3K4高表达为GDM发生的危险因素(P<0.01),见表5。

表5 Logistic回归分析影响GDM发生的危险因素

3 讨 论

GDM是指妊娠前糖代谢正常,但妊娠期孕妇体内的糖耐量水平受损及空腹血糖水平升高[9]。随着人类生活水平提高以及饮食的变化,GDM的发病率逐年增加[10]。在怀孕期间，发生不良妊娠的风险几率增加,对所有待产孕妇及新生儿的生命健康造成严重威胁[11]。早期对GDM进行诊断能够尽早改善孕妇的妊娠过程,因此寻找GDM诊断相关的指标具有重要的临床价值。

circRNA是近期发现的内源性非编码RNA,研究发现circRNA在基因表达的调控中起着重要作用,在临床诊断和治疗中可作为潜在的生物指标[12]。circRNA参与调节糖尿病患者胰岛素的分泌[13]。circFOXP1已成为胰岛素和生长因子作用的重要靶标,其在细胞生长、分化和应激反应中起着关键作用[14]。circFOXP1在人体组织中广泛表达并调节许多组织的发育,包括心脏、胸腺和肺[15]。circFOXP1缺陷胚胎在心脏形态发生方面存在严重缺陷,包括流出道分隔和垫层缺陷,导致胚胎死亡[16]。本次研究表明,与对照组比较,GDM组患者血清中circFOXP1水平显著降低,推测在GDM的发展中,circFOXP1可能起调控作用,表明circFOXP1可能参与了GDM的发生进程。ROC曲线结果表明,circFOXP1诊断GDM发生的AUC为0.873,敏感度为0.825,特异度为0.778,表明circFOXP1对GDM的诊断有一定的效能,有成为诊断GDM发生的潜力。多因素分析结果显示,circFOXP1低表达为GDM发生的危险因素,进一步说明circFOXP1可能成为诊断GDM发生的生物标志物。

除胎盘外,circMAP3K4在几种胰岛素靶向组织中也表达丰富,如骨骼肌、肝脏和心脏[17]。circMAP6K3的m4A修饰可以影响其二级结构剪接、降解或分子稳定性,从而影响其表达[18]。有研究结果表明,circMAP3K4参与妊娠期间葡萄糖代谢过程,发现circMAP3K4在GDM患者的胎盘组织中高表达[7,19]。研究表明,circMAP3K4在参与调节母体葡萄糖代谢的过程中,会进一步影响胎盘的表观遗传变化[20]。本次研究表明,GDM组患者血清中circMAP3K4水平显著高于对照组,与以往研究结果一致[19],表明circMAP3K4在GDM患者血清中高表达,在一定范围内影响葡萄糖的代谢过程。ROC曲线分析结果显示,circMAP3K4诊断GDM发生的AUC为0.842,敏感度为0.854,特异度为0.745,提示circMAP3K4的水平对GDM具有一定的诊断效能;多因素分析结果显示,circMAP3K4高表达为GDM发生的危险因素,提示circMAP3K4可能参与GDM的发生及进展,有望成为新的诊断GDM的潜在靶点。

相关性分析显示,GDM患者血清circFOXP1与circMAP3K4基因表达水平呈负相关,表明二者共同参与GDM的发生,从而影响到GDM患者的糖代谢稳态。二者联合诊断GDM的AUC高于血清circFOXP1和circMAP3K4单独诊断的AUC值,表明二者联合诊断价值优于单一指标检测的诊断价值,能够提高GDM的诊断效能。

综上所述,在GDM患者血清中circFOXP1呈低表达,circMAP3K4呈高表达,二者是GDM发生的危险因素,可以作为早期GDM诊断的生物标志物。但本次研究数量较少,GDM的发生过程较为复杂,后续将扩大样本数量及延长研究时间,为GDM的研究提供可靠的临床数据。

利益冲突：所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明

肖波、方娟:设计研究方案,实施研究过程,分析试验数据;张远远:资料搜集整理,论文撰写,论文修改;王燕:设计研究方案,分析试验数据;吴利荣:资料搜集整理,进行统计学分析,论文修改